張 琳，傅若秋，段冬玉，李紫薇，陳劍鴻

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的40% ～50%[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）列為Ⅳ級[2]。GBM 患者中位生存期約為18 個(gè)月，30%的患者生存期為2年，達(dá)到5年生存期的患者低于7%[3-5]。目前，對于GBM 的標(biāo)準(zhǔn)療法為手術(shù)切除聯(lián)合放射治療，并采用替莫唑胺輔以化學(xué)治療（簡稱化療）[6-7]。標(biāo)準(zhǔn)療法盡管在一定程度上延長了患者的生存時(shí)間，但預(yù)后仍不樂觀，主要原因?yàn)镚BM 對化療藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重耐藥性，最終導(dǎo)致治療失敗[8-9]。故尋找一種新型抗膠質(zhì)瘤藥物是目前亟須解決的問題。黃楊堿（CVBD）是小葉黃楊及其同屬植物中提取的生物堿，最初用于治療心律失常等疾病[10]。有研究表明，CVBD對乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞具有抑制作用[11-13]，但目前尚無抗GBM 作用及機(jī)制研究的報(bào)道。本研究中探討了CVBD 抗GBM 細(xì)胞T98G（簡稱T98G 細(xì)胞）活性的初步機(jī)制，發(fā)現(xiàn)CVBD 可能通過Akt/mTOR/ERK信號通路誘導(dǎo)了T98G 細(xì)胞的凋亡，并阻礙了其自噬降解過程，為將CVBD 進(jìn)一步開發(fā)成新型抗膠質(zhì)瘤藥物提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

1.1.1 儀器

HR30-11A2 型生物安全柜（青島海爾股份有限公司）；3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美 國Thermo 公司）；CKX41 型光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；EVOSF1 型熒光顯微鏡（美國Thermo 公司）；GS-15K型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman 公司）；STNERGY H1型酶標(biāo)儀（美國Agilent 公司）；C6 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；165-8001 型蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、Chem I Doc 型超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.1.2 試藥

CVBD（成都曼思特生物科技有限公司，批號為MUST-18081102，純度≥99%）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號為SH30022.01）；胎牛血清（天津康源生物技術(shù)有限公司，批號為20180918）；胰酶消化液（批號為C0201），western 細(xì)胞裂解液（批號為P0031），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型，批號為P0009），均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白（美國Thermo 公司，批號為26619）；cleaved-Caspase 3（C- Caspase 3，批號為19677-1-AP），PARP（批號為13371-1-AP），均購自美國Proteintech 公司；GADPH（美國Cell Signaling Technology 公司，批號為2118S）；phospho-Akt（P-Akt，美國CST 公司，批號為4060S）；phospho-ERK（P-ERK，批 號 為ab50011），phosphomTOR （P-mTOR，批 號 為ab137133），ERK（批 號 為ab17942），Akt（批 號 為 ab200195），mTOR（批 號 為ab2723），均購自美國Abcam 公司；LC3Ⅱ（美國Sigma 公司，批號為L7543）及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號為ZB2305）；Bafilomycin A1（批號為HY-00558）及CCK-8 試劑盒（美國MCE公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號為556547）；Rapamycin（美國Selleck Chemicals 公司，批號為S1039）。

1.1.3 細(xì)胞

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G 源于美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

T98G 細(xì)胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基在適宜濕度、37 ℃及5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)，隔1 d換液，待細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代，取對數(shù)期生長細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和CVBD1，2，3，4 組（40，80，120，160 μmol/L）。同法培養(yǎng)T98G 細(xì)胞24 h。

1.2.2 細(xì)胞存活率的檢測

將T98G 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，按1.2.1 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞。每孔加入10 μL CCK-8 工作液，恒溫孵育2 h，于450 nm 波長處檢測吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測

T98G 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，按1.2.1 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞。去除培養(yǎng)基，取1 mL PBS 漂洗1 遍后加500 μL胰酶消化液，輕柔吹打，混勻，轉(zhuǎn)移至離心管，800 r/min離心5 min。去除上清液，PBS 清洗2 遍，800 r/min 離心5 min。用Annexin V-FITC/PI 雙染色，即將2 μL PI 與5 μL FITC 和100 μL binding buffer 混勻，并輕柔重懸細(xì)胞團(tuán)，室溫避光處染色15 min。用流式細(xì)胞儀檢測T98G細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。

1.2.4 蛋白表達(dá)水平

T98G 細(xì)胞以1.5×106個(gè)/皿的密度接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，按1.2.1 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞。提取T98G 全細(xì)胞蛋白，用BCA 法測定蛋白含量。每組加入5×loading buffer 渦旋混勻，96 ℃金屬浴，使蛋白變性得蛋白樣品。每組取15 μg 上樣，在電壓為60 ～120 V 條件下，進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳（SDSPAGE）90 min。恒電流300 mA 轉(zhuǎn)膜150 min 至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，TBST 漂洗，4 ℃孵育目標(biāo)抗體至過夜。次日回收一抗，TBST 漂洗，在室溫下孵育相應(yīng)二抗2 h。TBST 漂洗后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞自噬情況

T98G 細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)分為對照組（A 組，0 μmol/L）及CVBD 組（B 組，120 μmol/L）、Bafilomycin A1 組（C 組，20 nmol/L）、Rapamycin 組（D 組，0.25 μmol/L）。以Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染tfLC3 質(zhì)粒。取2 支1.5 mL 離心管，先分別加入25 μL Opti-MEM，其后，1 支加入0.75 μL Lipofectamine 3000，另1 支加入500 ng tfLC3 質(zhì)粒和1 μL P3000 試劑，充分混勻。將2 支離心管的內(nèi)容物混勻，室溫孵育5 min，形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物。將質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物加入細(xì)胞中，每孔50 μL，振搖，混勻，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，換液，24 h 后分組，同1.2.1 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，行單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

與對照組比較，CVBD 1 組、2 組、3 組、4 組的細(xì)胞存活率隨著CVBD 濃度的增加而逐漸降低，且呈量效依賴趨勢（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡情況

與對照組比較，CVBD 1 組、2 組、3 組、4 組的細(xì)胞凋亡率隨著CVBD 濃度的增加而逐漸升高，且呈量效依賴趨勢（P＜0.05）。詳見表1 和圖1。

表1 各組T98G 細(xì)胞存活率和凋亡率比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of viability rate and apoptosis rate of T98G cells in each group（±s，n=3）

表1 各組T98G 細(xì)胞存活率和凋亡率比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of viability rate and apoptosis rate of T98G cells in each group（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。表2 同。Note：Compared with those in the control group，*P ＜0.05，as well as Tab.2.

組別對照組黃楊堿1 組黃楊堿2 組黃楊堿3 組黃楊堿4 組濃度（μmol/L）04080120160細(xì)胞存活率（%）100.0059.62±3.94*49.46±3.34*47.92±2.57*41.49±3.66*細(xì)胞凋亡率（%）3.86±0.5215.64±0.69*38.37±1.32*44.16±1.42*49.93±2.34*

圖1 T98G 細(xì)胞凋亡情況Fig.1 The apoptosis of T98G cells

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與 對 照 組 比 較，CVBD 1 組、2 組、3 組、4 組cleaved-PARP（C-PARP）和C-Caspase3 蛋 白 表 達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表2 和圖2。

表2 各組細(xì)胞凋亡、信號通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis，signaling pathway and autophagy related-proteins of cells in each group（±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞凋亡、信號通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis，signaling pathway and autophagy related-proteins of cells in each group（±s，n=3）

組別對照組黃楊堿1 組黃楊堿2 組黃楊堿3 組黃楊堿4 組濃度（μmol/L）04080120160 C-PARP/PARP 0.263±0.0960.400±0.055*1.005±0.135*2.663±0.396*3.326±0.538*C-Caspase 3/GAPDH 0.017±0.0030.129±0.025*0.913±0.078*1.069±0.120*1.308±0.099*P-Akt/Akt 0.636±0.0400.626±0.0290.645±0.0530.292±0.035*0.181±0.012*P-mTOR/mTOR 0.968±0.0400.972±0.0070.698±0.078*0.400±0.033*0.320±0.014*P-ERK/ERK 1.163±0.1351.113±0.1680.493±0.157*0.263±0.029*0.235±0.013*LC3Ⅱ/GAPDH 0.452±0.1291.015±0.092*1.131±0.041*1.172±0.016*1.287±0.042*

圖2 T98G 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.2 The expression of apoptosis-related proteins of T98G cells

2.4 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對照組比較，CVBD 2 組、3 組、4 組的P-mTOR和P-ERK 蛋白表達(dá)水平及CVBD 3 組、4 組的P-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低。詳見表2 和圖3。

2.5 細(xì)胞自噬情況

與對照組比較，CVBD 1 組、2 組、3 組、4 組的LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表2 和圖4 A。通過熒光顯微鏡觀察熒光團(tuán)發(fā)現(xiàn)，CVBD 與Bafilomycin A1 分別作用于T98G 細(xì)胞后均只觀察到黃色熒光點(diǎn)，而Rapamycin 作用于T98G 細(xì)胞后能觀察到較多的紅色熒光點(diǎn)。詳見圖4 B。

3 討論

CVBD 最初用于治療心律失常等疾病[10]。近年來，越來越多的研究揭示了CVBD 新的藥理學(xué)效應(yīng)，如抗腫瘤活性。研究表明，CVBD 對乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌及胃癌腫瘤細(xì)胞有一定抑制作用，可通過抑制細(xì)胞增殖、阻礙細(xì)胞侵襲、引起線粒體損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11-14]。

PARP 即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，是一類影響細(xì)胞生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)超家族，在DNA 修復(fù)、基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞程序性死亡中發(fā)揮著重要作用[15]。PARP 還是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶（Caspase）的切割底物，發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase 信號通路被激活，啟動(dòng)Caspase依賴的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，而PARP 的降解和Caspase3 的激活被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志性事件[16]。本研究結(jié)果顯示，CVBD 可抑制T98G 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度依賴趨勢。此外，CVBD 還可激活凋亡相關(guān)蛋白PARP 的降解，升高C-PARP 和C-Caspase3蛋白表達(dá)水平，也呈濃度依賴趨勢，表明CVBD 通過激活Caspase3 凋亡信號通路誘導(dǎo)T98G 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.3 The expression of signaling pathway related-proteins of T98G cells

圖4 T98G 細(xì)胞自噬情況A.Expression of LC3 Ⅱprotein B.Fluorescence microscopyFig.4 Autophagy of T98G cells

Akt/mTOR 信號通路在調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡方面起著關(guān)鍵作用。有研究表明，Akt/mTOR 信號通路的過度激活可使腫瘤細(xì)胞存活[17]。FENG 等[18]發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)P-AKT 和P-mTOR 可誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，CVBD 可降低P-Akt 和P-mTOR蛋白表達(dá)水平，提示CVBD 可能通過Akt/mTOR 信號通路誘導(dǎo)T98G 細(xì)胞發(fā)生凋亡。ERK 屬絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，它的激活與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)，而磷酸化的ERK 可上調(diào)下游致癌激酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、生長和侵襲[19]。有研究顯示，金絲桃素可通過降低ERK 磷酸化水平誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[20]。LIN 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過抑制ERK 激活，阻滯骨肉瘤細(xì)胞周期和抑制侵襲，最終導(dǎo)致其凋亡。本研究結(jié)果顯示，CVBD 可降低ERK 磷酸化水平，提示可能通過抑制ERK 通路抑制T98G 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。此外，Akt/mTOR 信號通路還與自噬密切相關(guān)，AKT 是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，位于PI3K下游，在Ⅰ型PI3K 作用下可形成P-AKT，mTOR 是PI3K/Akt 下游的一種重要蛋白激酶，與細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡密切相關(guān)，同時(shí)也是調(diào)控自噬的重要因子[22-23]。本研究結(jié)果表明，CVBD 可降低P-Akt 和P-mTOR 的表達(dá)水平，說明CVBD 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與自噬有關(guān)。

自噬是細(xì)胞的一個(gè)生物學(xué)過程，細(xì)胞內(nèi)部的待降解底物由雙層膜包裹后形成自噬小體，然后和溶酶體融合形成自噬溶酶體，待降解物經(jīng)過溶酶體酸性環(huán)境被水解后，回到細(xì)胞質(zhì)再循環(huán)利用[24]。如果自噬過程被阻斷，自噬小體無法與溶酶體結(jié)合，那么自噬小體將會(huì)過度堆積，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡[25]。有研究顯示，CVBD 可通過激活自噬誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[12]。但僅通過LC3Ⅱ水平升高就推斷是誘導(dǎo)自噬顯然是不夠的。本研究運(yùn)用了檢測自噬流的“金標(biāo)準(zhǔn)”，即轉(zhuǎn)染tfLC3 雙光質(zhì)粒，結(jié)果表明，CVBD 可升高自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)水平，同時(shí)轉(zhuǎn)染tfLC3 質(zhì)粒后可引起T98G 細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生黃色熒光團(tuán)，以上結(jié)果證實(shí)CVBD 阻斷了自噬降解過程。然而阻斷自噬的原因有多種，CVBD 阻斷細(xì)胞自噬降解的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CVBD 可抑制T98G 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能是通過Akt/mTOR/ERK 信號通路激活了Caspase 凋亡途徑且阻礙了T98G 細(xì)胞的自噬降解過程，最終導(dǎo)致T98G 細(xì)胞凋亡。