周俊明，李敏利，孫 博，吳曉尉，王 彬，郭美霞，王小敏

0 引 言

維生素A缺乏(vitamin A deficiency，VAD)已成為目前發(fā)展中國家面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一[1]。維生素A的經(jīng)典共識是維持正常視覺功能，維護(hù)上皮組織細(xì)胞的健康，促進(jìn)免疫球蛋白的合成并維持骨骼肌正常生長發(fā)育[2]。新近臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)維生素A水平參與多種腸道屏障功能相關(guān)疾病的病理過程[3]。腸道菌群是近年來被廣泛研究的新生命體，被稱為“隱藏的器官”，它包括的細(xì)菌體及其代謝產(chǎn)物參與多種營養(yǎng)、代謝、免疫生理過程[4-6]。腸道菌群失衡與炎癥性腸病的炎癥反應(yīng)聯(lián)系緊密，但維生素A是否通過影響腸道菌群參與腸道屏障和腸道炎癥的病理生理過程仍不完全清楚[7]。

本研究以VAD模型小鼠為研究對象，通過16s DNA測序等方法分析其腸道菌群變化，腸黏膜滲透性和腸道局部炎癥水平，探究維生素A在腸道菌群紊亂相關(guān)的腸道炎癥損傷中的角色，為后續(xù)通過維生素A補充(VA-Normal，VAN)調(diào)節(jié)基于腸道菌群的腸道損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料動物實驗所需8周齡C57BL/6雌性小鼠，32只，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2012-0004，小鼠飼養(yǎng)于SPF級標(biāo)準(zhǔn)動物房,室溫25 ℃,自由進(jìn)食進(jìn)水，晝夜周期為12 h。小鼠定制純化飼料VAD(VA <120 IU/kg)及VAN(VA 15000 IU/kg)購自常州鼠一鼠二動物飼料公司(各組小鼠飲食熱量及其余成分?jǐn)z入均匹配)。飼養(yǎng)過程及實驗操作嚴(yán)格遵循美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護(hù)理及使用指南(NIH Publication No.8023,revised 1978)。

實驗儀器：StepOnePlusTMReal-Time PCR System(ABI，美國)，酶標(biāo)儀Model 560(Bio-Rad，美國)，包埋機(jī)(俊杰電子，中國)，冰凍切片機(jī)(Leica，德國)，HPLC檢測系統(tǒng)(Waters Millenium，美國)，相差顯微鏡(Zeiss，德國)。

實驗試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Abcam，美國)，SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa，日本)，HE染色套裝(谷歌生物，中國)，QIAamp?DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)，High-Sensitivity DNA Assay Kit(Life，美國)，IlluiminaMiSeq System(Illumina，美國)，目的基因和內(nèi)參照引物(金斯瑞，中國)，小鼠IL-6/TNF-α ELISA試劑盒(酶聯(lián)生物，中國)。

1.2方法

1.2.1 實驗動物及模型建立模型建立參照文獻(xiàn)[8-9]，將雄性子鼠分為VAN組、VAD組和維生素A缺乏補充(VAD-Normal,VADN)組，6只/組。VAN組：自孕鼠VAN飲食，子鼠生后VAN孕鼠哺乳，生后3周斷乳，斷乳后予VAN飼料至11周齡；VAD組：自孕鼠VAD飲食，生后VAD孕鼠哺乳，斷乳后予VAD飼料至11周齡。VADN組：11周齡VAD組子鼠改予VAN飲食繼續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2血清維生素A水平檢測實驗結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將預(yù)先準(zhǔn)備好的合適長度毛細(xì)玻璃管從眼內(nèi)眥呈45°角向小鼠眼內(nèi)旋轉(zhuǎn)刺入，避光收集血液，以離心半徑13.5 cm、2000 r/min離心20 min 后取上清，收集好的樣品送至上海艾迪康生物有限公司進(jìn)行檢測。

1.2.3腸道菌群取樣及測序分析實驗結(jié)束后小鼠消毒后在無菌環(huán)境中迅速取出盲腸，用滅菌止血鉗將內(nèi)容物擠壓至專門收樣管內(nèi)，迅速液氮冷凍。按照建庫試劑盒提取DNA后至長沙人與未來生物科技有限公司行16S rRNA基因測序。使用Qubit定量系統(tǒng)確定文庫。

1.2.4腸道組織切片HE染色收集小鼠結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定后脫水、浸蠟、包埋、切片。依次蘇木精染色-鹽酸分化-伊紅染色，接著梯度脫水脫蠟后用中性樹膠封固，在顯微鏡下拍照觀察并評價小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)及隱窩深度。

1.2.5腸道屏障標(biāo)志物q-PCR檢測收集小鼠腸組織冰上研磨，用Trizol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明(42 ℃ 2 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)合成cDNA。q-PCR法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)40次。相對表達(dá)量用為2-△△CT計算方法。小鼠β-actin作為內(nèi)參，引物設(shè)計來自Gene bank(PubMed)，序列如下：ZO-1:Forward CAAAGCCCACCAAGGTCAC Reverse TCTCTTTCCGAGGCATTAGCA;Occludin:ForwardTGGCTATGGAGGCGGCTATGG Reverse ACCGATACCTCCGCCGATACC;β-actin:Forward GAGAGGGAAATCGTGCGTGACA Reverse ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAA。

1.2.6腸道組織炎癥因子ELISA檢測剪取各組小鼠腸道組織適量，洗滌后加入裂解液冰上裂解10 min，然后用超聲研磨成細(xì)胞勻漿液，4 ℃下以離心半徑8 cm、13 000 r/min離心10 min 后收集上清。按照ELISA說明書操作通過酶聯(lián)免疫法測小腸組織TNF-α和IL-6的水平。樣品濃度經(jīng)過蛋白總量校正。

2 結(jié) 果

2.1 VAD飲食對小鼠血清視黃醇水平和體重的影響與VAN相比，VAD組小鼠血清視黃醇水平顯著降低(P<0.01)；與VAD組相比，VADN組小鼠視黃醇水平顯著升高(P<0.01)。VAD組小鼠體重較VAN組有少許下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重及血清視黃醇水平Table 1 Comparison of weight and retinol levels inthese groups

2.2VAD飲食對小鼠菌群結(jié)構(gòu)的影響共從樣本中獲得669 359個有效序列，序列平均長度337 bp。將相似度大于97%的OTUs聚類比較，VAD組小鼠OTUs數(shù)量較VAN組降低，見圖1。VAD組較VAN組小鼠Chao、Shannon指數(shù)數(shù)值降低，Simpson指數(shù)數(shù)值升高(P<0.05),見圖2。β多樣性-主成分分析(PCoA)坐標(biāo)顯示，3組小鼠腸道菌群組內(nèi)構(gòu)成重復(fù)性較好，但組間差異分布離散，其中VAD小鼠細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)占總變化的46.09%，見圖3。OUT分布的維恩(Venn)圖示8個OUTs為VAD小鼠獨有，31個OUTs分布在VAN小鼠，提示組間菌群分布存在差異，見圖4。

圖1 各組小鼠OTUs分布特征Figure 1 The distribution characteristics of OTUs of mice in different group of mice

與VAN組比較，*P<0.05;與VAD組比較，#P<0.05圖2 各組小鼠腸道菌群的Chao、Shannon及Shimpon指數(shù)Figure 2 TheChao,Shannon and Shimpon indexes of the intestinal microbiota of mice in different groups

圖3 各組小鼠腸道菌群的主成分分析圖(PCoA/PCA)圖Figure 3 Principal component analysis (PCoA/PCA) of the intestinal microbiota of mice in different groups

2.3VAD飲食對小鼠各個水平優(yōu)勢菌群分布的影響優(yōu)勢菌群分析顯示門水平VAN小鼠的腸道菌群主要依次為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、TM7、軟壁菌門(Tenericutes)。相較于VAN組，VAD組小鼠的藍(lán)藻菌門和疣微菌門相對豐度顯著上升，脫鐵桿菌門相對豐度明顯下降；擬桿菌門和厚壁菌門豐度呈不同程度降低，變形菌門豐度升高。與VAN組比較，VAD組小鼠厚壁菌門與擬桿菌門(F/B)豐度比值上升(P<0.05)，與VAD組比較，VADN組F/B豐度比值降低(P<0.05)。隨著菌群不同水平分類細(xì)化，各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)差異各有不同但有相似性，在綱水平和目水平，VAD小鼠的疣微菌系列豐度均顯著升高。見圖5。

2.4VAD飲食對小鼠腸道菌群核心差異分類單元的影響宏基因組分析結(jié)果示，疣微菌門可作為VAN小鼠的生物標(biāo)志物；TM7可作為VAN小鼠的生物標(biāo)志物；變形菌門可作為VADN鼠的生物標(biāo)志物，見圖6。各組小鼠核心差異分類單元分析結(jié)果顯示，VAD小鼠疣微菌門豐度增加最顯著，見圖7。

圖6 小鼠分類學(xué)分支進(jìn)化(Cladogram)圖Figure 6 Cladogram diagram of the taxonomy of mice indifferent groups

圖7 各組小鼠中富集的分類單元的梯形圖Figure 7 Ladder Logic Programming Language (LAD) of the taxa enriched of mice in different groups

2.5VAD飲食對小鼠腸道形態(tài)及腸道炎癥水平的影響染色結(jié)果表明，相比于VAN和VADN組小鼠，VAD小鼠腸黏膜形態(tài)上皮細(xì)胞排列紊亂，見圖8。與VAD組比較，VAN組和VADN組Occludin和 ZO-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而炎性因子TNF-α和IL-6含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

a:VAN組;b:VAD組;c:VADN組圖8 鏡下觀察各組小鼠腸形態(tài)(HE ×20)Figure 8 HE staining of intestinal morphology of mice in different groups(HE ×20)

表2 各組小鼠腸道緊密連接蛋白mRNA和相對道炎癥因子蛋白表達(dá)水平Table 2 mRNA expression ofintestinal permeability markersandprotein expression ofintestinal inflammatory cytokinesin different groups

3 討 論

目前VAD診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清視黃醇水平低于0.7 μmol/L[10]。研究證實，血清維生素A水平在肝維生素A穩(wěn)態(tài)嚴(yán)格管控下，血清維生素A含量下降一般在肝儲存的維生素A已無法滿足機(jī)體維生素A代謝需求后出現(xiàn)[11- 12]。產(chǎn)后3周被剝奪維生素A的小鼠20周齡時血清視黃醇水平仍正常[13]。本研究自妊娠開始利用VAD飲食誘導(dǎo)VAD模型小鼠，至11周齡時子鼠平均血清視黃醇濃度為0.65 μmol/L(<0.7 μmol/L)，表明VAD模型小鼠構(gòu)建成功，與既往文獻(xiàn)結(jié)果基本一致[8- 9]。此模型是我們下一步探究維生素A對腸道菌群改變及其對腸道屏障及炎癥影響的基礎(chǔ)。

腸道菌群的多樣性、豐富度和均勻性是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)[14]。本研究中VAD小鼠腸道菌群豐度和多樣性均下降，提示腸道菌群結(jié)構(gòu)組成改變可能與體內(nèi)維生素A水平相關(guān)。比較各組小鼠在不同分類水平上的菌群分布變化，VAD小鼠F/B比值顯著升高，這與既往研究證實在鼠和人的腸道菌群中，F(xiàn)/B是主要優(yōu)勢菌群，其相對豐度比值是機(jī)體微生物結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)[15]，F(xiàn)/B的比例失衡參與多種疾病狀態(tài)的結(jié)論相似[16-17]。變形菌門在正常腸道內(nèi)含量較低，常低于8%，且多數(shù)為致病菌，它異常擴(kuò)增也是腸道微生物失調(diào)的微生物信號之一[18]。本研究中VAD小鼠變形菌門豐度顯著升高，說明變形菌門改變可能是機(jī)體營養(yǎng)缺乏狀態(tài)導(dǎo)致的病理表型之一。因此，維生素A或可通過影響厚壁菌、擬桿菌及變形菌此類具有針對有益菌及致病菌豐度調(diào)節(jié)作用的菌群豐度等來影響小鼠腸道微生物組成結(jié)構(gòu)，但仍需要通過更有效的宏基因組表征腸道菌群功能水平上的代謝組分析，探索更詳細(xì)的分級變化來闡明這些變化對腸道菌群及腸道功能的影響。

腸道菌群變化可通過多種途徑參與機(jī)體免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)[7]。腸黏膜上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白-跨膜蛋白(Occludin等)和胞質(zhì)蛋白(ZO-1等)的表達(dá)參與構(gòu)建腸黏膜屏障，防止致病物質(zhì)侵害[19-20]。我們進(jìn)一步檢測小鼠腸道屏障蛋白及腸道炎癥因子的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，VAD小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞的Occludin和ZO-1mRNA表達(dá)明顯下降，提示腸道上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，腸黏膜通透性增加。既往研究發(fā)現(xiàn)VAD可誘導(dǎo)雞和大鼠小腸形態(tài)和功能的改變，與我們的結(jié)果部分一致[21- 22]。有研究證實基于腸道菌群失調(diào)所致的腸道微生態(tài)環(huán)境破壞，會導(dǎo)致宿主系統(tǒng)慢性炎癥[23]。本研究VAD小鼠腸道炎癥因子TNF-α和IL-6明顯升高，提示VAD可導(dǎo)致不同種屬腸道菌群在組成和數(shù)目上的分布差別，降低腸道抗定植能力，機(jī)體有益菌減少從而導(dǎo)致機(jī)會感染而致病。這也與VADN小鼠的腸道菌群豐度增加，伴隨腸屏障功能改善結(jié)果相吻合。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VAD導(dǎo)致的小鼠腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致腸上皮黏膜通透性增強(qiáng)，促炎因子分泌增加，促進(jìn)屏障功能損傷，這可能是VAD導(dǎo)致腸道損傷的機(jī)制之一。未來仍需進(jìn)一步工作探究并闡明維生素A代謝與腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的腸道疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及背后調(diào)控機(jī)制，尋找基于維生素A水平參與的腸道功能保護(hù)靶點，為未來維生素A參與體內(nèi)多器官生理功能維持提供新見解。