徐 杰，李 剛，張 凡，周永順，何 營(yíng)，韓 凱，陳福龍，高劍峰

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一氧化氮(NO)產(chǎn)生過(guò)程中的限速酶[1]，其主要包括3種亞型，即誘導(dǎo)型(iNOS、NOS2)、神經(jīng)元型(nNOS、NOS1)和內(nèi)皮型(eNOS、NOS3)[2]，其中后兩者又被統(tǒng)稱(chēng)為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。cNOS主要存在于體細(xì)胞中，可以產(chǎn)生少量的NO用于維持正常生理活動(dòng)；iNOS則存在于各種炎癥細(xì)胞中，在某些因素誘導(dǎo)下產(chǎn)生大量的NO[3]，在炎癥的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[4]。目前對(duì)于iNOS的研究大多集中在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]、瘧疾[6]、慢性胰腺炎[7]、高血壓[8]、糖尿病[9]、乳腺炎[10]等疾病上，例如Negi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，iNOS基因啟動(dòng)子的多態(tài)性可以增加南印度泰米爾類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，且iNOS的多態(tài)性與機(jī)體的免疫疾病有關(guān)。Kumar等[6]研究發(fā)現(xiàn)，iNOS的多態(tài)性影響NOS的表達(dá)和NO的生成，可作為評(píng)價(jià)臨床瘧疾的潛在診斷指標(biāo)。

布魯菌(Brucella)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，能直接或者間接地感染人或動(dòng)物[11-12]，對(duì)于發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)的人畜產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害[13-15]。羊布魯菌是布魯菌中致病力最強(qiáng)的一種[16]。近年來(lái)，對(duì)iNOS的研究大多集中在各種炎癥相關(guān)的疾病上，而在iNOS多態(tài)性與綿羊布魯菌易感性方面的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)以哈薩克羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)檢測(cè)試羊布魯菌感染狀況，并利用PCR-SSCP技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)iNOS基因的多態(tài)性，分析iNOS基因多態(tài)性與布魯菌易感性的關(guān)系，旨在為抗布魯菌病綿羊的選育提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

虎紅平板凝集抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，購(gòu)于哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMaster Mix等試劑，購(gòu)于北京天根生物公司。選取新疆伊犁霍城縣某羊群231只哈薩克羊作為試驗(yàn)群體，頸靜脈采血5 mL/只，其中4 mL置于肝素鈉抗凝采血管中，用于iNOS基因多態(tài)性檢測(cè)；剩余1 mL置于1.5 mL離心管中，析出血清用于布魯菌血清學(xué)檢測(cè)。

1.2 哈薩克羊布魯菌病的血清學(xué)檢測(cè)

采用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)對(duì)試羊進(jìn)行布魯菌病血清學(xué)檢測(cè)[17]。取30 μL虎紅平板凝集抗原于載玻片上，分別與等體積的被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清吹打混勻，室溫下靜置，5 min內(nèi)觀察，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清會(huì)出現(xiàn)不同程度的顆粒狀或玫瑰花瓣?duì)钅F(xiàn)象，而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清無(wú)變化，以此作為標(biāo)準(zhǔn)判定被檢血清，對(duì)陽(yáng)性血清復(fù)檢一次，若仍呈陽(yáng)性則判定為布魯菌感染陽(yáng)性。

1.3 哈薩克羊iNOS基因多態(tài)性的檢測(cè)

1.3.1 血液基因組DNA的提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒提取哈薩克羊血液基因組DNA，用盤(pán)檢法[18]檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度為12.5～25 ng/μL，符合試驗(yàn)要求，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2iNOS基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中已公布的綿羊11號(hào)染色體上iNOS基因序列(登錄號(hào)：NC_019468.2)，使用Primer Premier 5.0軟件，針對(duì)其2，4，5外顯子及其鄰近內(nèi)含子片段(exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron)，分別設(shè)計(jì)引物FP-2/RP-2、FP-4/RP-4、FP-5/RP-5。引物由華大基因科技股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：8 μL的2×TaqMaster Mix，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL(空白對(duì)照不加DNA模板)，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL，以ddH2O代替DNA模板的處理作為空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

表1 iNOS基因PCR擴(kuò)增引物的序列信息

1.3.3iNOS基因多態(tài)性的SSCP分析 采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)231個(gè)樣本進(jìn)行基因型分型檢測(cè)，SSCP反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[19]，部分更改后于9 ℃條件下300 V預(yù)電泳15 min，然后14 mA恒流電泳12 h。

1.3.4 測(cè) 序 根據(jù)SSCP電泳的結(jié)果，每種帶型選取3個(gè)樣本送至北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序分析儀型號(hào)為3730XL。用MEGA 6.06和DNAMAN 5.2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，并分析哈薩克羊iNOS基因3個(gè)外顯子及其緊鄰內(nèi)含子中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)SNPs和測(cè)序結(jié)果，分析iNOS基因3個(gè)片段的突變位點(diǎn)及其基因型，計(jì)算iNOS基因的遺傳參數(shù)(基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(H)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息量(PIC))，并采用χ2檢驗(yàn)方法分析iNOS基因3個(gè)片段的突變位點(diǎn)遺傳多態(tài)性與布魯菌易感性的相關(guān)性。使用SPSS 20對(duì)哈薩克羊數(shù)量、感染率進(jìn)行整理分析；使用在線(xiàn)的生物信息學(xué)軟件RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)對(duì)RNA的二級(jí)機(jī)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用PRAB(Ihttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat. pl? page=/NPSA/npsa_server.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈薩克羊布魯菌病的RBPT檢測(cè)

對(duì)血清RBPT檢測(cè)(圖1)發(fā)現(xiàn)，164只羊的血清未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，判定為布魯菌感染陰性；67只羊的血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，判定為布魯菌感染陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為29.00%。

圖1 哈薩克羊布魯菌病的RBPT檢測(cè)結(jié)果

2.2 哈薩克羊iNOS基因目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增

iNOS基因exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，分別獲得了296，201，231 bp的片段(圖2)，與預(yù)期的片段長(zhǎng)度一致，瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無(wú)拖帶現(xiàn)象，可用于后續(xù)的測(cè)序分析和PCR-SSCP試驗(yàn)。

a.Exon 2/intron；b.Exon 4/intron；c.Exon 5/intron；M為DL500 Marker；1為空白對(duì)照；2～3為目標(biāo)產(chǎn)物

2.3 哈薩克羊iNOS基因的多態(tài)性分析

經(jīng)PCR-SSCP檢測(cè)(圖3)、測(cè)序(圖4)可知，exon 2/intron片段的1 910位堿基發(fā)生C→T突變，命名為F2-C1910T，有1個(gè)等位基因C，有CC、CT 2種基因型。exon 4/intron片段出現(xiàn)了2處突變，其一為11 519位堿基發(fā)生T→C突變，命名為F4-T11519C，有T、C 2個(gè)等位基因，有TT、CC、TC 3種基因型；其二為11 546位堿基發(fā)生A→G突變，命名為F4-A11546G，有A、G 2個(gè)等位基因，有AA、AG、GG 3種基因型。exon 5/intron片段的12 707位堿基發(fā)生C→T突變，命名為F5-C12707T，有C、T 2個(gè)等位基因，有CC、TT、CT 3種基因型。

1～14為不同試羊的PCR-SSCP帶型。a.Exon 2/intron片段，其中1，3～14為CC型，2為CT型。b.Exon 4/intron片段，在F4-T11519C突變中，2，3，4，7，8，10，11，14為T(mén)T型，13為CC型，1，5，6，9，12為T(mén)C型；在F4-A11546G突變中，2，3，4，7，8，10，11，14為AA型，13為GG型，1，5，6，9，12為AG型。c.Exon 5/intron片段，其中5和13為CC型，4和6為T(mén)T型，1，2，3，7～12，14為CT型

經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2-C1910T和F5-C120707T的突變未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，F(xiàn)4-T11519C的突變出現(xiàn)了氨基酸Cys→Arg的改變，F(xiàn)4-A11546G突變出現(xiàn)了氨基酸Lys→Glu的改變。

Ⅰ.Exon 2/intron片段F2-C1910T突變；Ⅱ.Exon 4/intron片段F4-T11519C突變；Ⅲ.Exon 4/intron片段F4-A11546G突變；Ⅳ.Exon 5/intron片段F5-C12707T突變

2.4 哈薩克羊iNOS基因的遺傳參數(shù)及其多態(tài)性與布魯菌易感性的相關(guān)性分析

由表2可知，F(xiàn)2-C1910T多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因和基因型分別是C和CC，其頻率分別是0.924和0.848；F4-T11519C多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因和基因型分別是T和TC，其頻率分別是0.714和0.528；F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因和基因型分別是A和AG，其頻率分別是0.714和0.528；F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因和基因型分別是C和CT，其頻率分別是0.600和0.506。

χ2檢驗(yàn)表明，F(xiàn)2-C1910T和F5-C12707T位點(diǎn)與布魯菌易感性的相關(guān)性不顯著(P>0.05)，F(xiàn)4-T11519C和F4-A11546G位點(diǎn)與布魯菌易感性極顯著相關(guān)(P<0.01)。F2-C1910T屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)；F4-T11519C、F4-A11546G和F5-C12707T的PIC在0.325～0.365，均屬于中度多態(tài)。

針對(duì)67只感染布魯菌的哈薩克羊進(jìn)一步進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)顯示，感染羊各位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因、多態(tài)性等與全體供試羊群體相比均未發(fā)生改變。F4-T11519C多態(tài)位點(diǎn)的CC基因型和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型出現(xiàn)了缺失。

表3 感染布魯菌哈薩克羊iNOS基因的遺傳參數(shù)及其多態(tài)性與布魯菌易感性的相關(guān)性

2.5 易感布魯菌哈薩克羊iNOS基因型分析

將布魯菌感染率明顯高于其他基因型的基因型定義為易感基因型，將布魯菌感染率最低的基因型定義為不易感基因型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)顯示，哈薩克羊iNOS基因F2-C1910T位點(diǎn)的易感基因型為CC；F4-T11519C位點(diǎn)的易感基因型為T(mén)T、TC，不易感基因型為CC；F4-A11519G位點(diǎn)的易感基因型為AA、AG，不易感基因型為GG；F5-C12707T位點(diǎn)的易感基因型為CC、CT，不易感基因型為T(mén)T。

表4 易感布魯菌哈薩克羊iNOS基因型分析

2.6 哈薩克羊iNOS基因的生物信息學(xué)分析

使用在線(xiàn)生物信息學(xué)分析軟件RNAfold WebServer對(duì)iNOS基因exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示。圖5顯示，除F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)最小自由能未發(fā)生改變外，其余多態(tài)位點(diǎn)的最小自由能均出現(xiàn)了不同程度改變，其中F2-C1910T多態(tài)位點(diǎn)最小自由能絕對(duì)值增加，造成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低；F4-T11519C和F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)最小自由能絕對(duì)值降低，使RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加；F2-C1910T和F4-T11519C突變均導(dǎo)致RNA 結(jié)構(gòu)改變；F4-A11546G和F5-C12707T突變未導(dǎo)致RNA結(jié)構(gòu)改變，但這些改變可能會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和后期的蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)過(guò)程產(chǎn)生一定的影響。

圖5 哈薩克羊iNOS基因exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron多態(tài)位點(diǎn)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用在線(xiàn)生物信息學(xué)分析軟件PRABI對(duì)iNOS基因exon 4/intron多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果(表5)表明，exon 4/intron基因編碼蛋白質(zhì)全部為α-螺旋蛋白，不存在β-轉(zhuǎn)角。錯(cuò)義突變F4-T11519C、F4-A11546G位點(diǎn)均未能引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

表5 哈薩克羊iNOS基因exon 4/intron多態(tài)位點(diǎn)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討 論

新疆作為我國(guó)重要的畜牧大省，擁有豐富的綿羊品種資源，布魯菌病的流行嚴(yán)重威脅著新疆畜牧業(yè)的快速發(fā)展，因此研究布魯菌病易感的分子機(jī)制一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究表明，iNOS的多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃癌等多種疾病存在一定的關(guān)聯(lián)性。Zhu等[20]通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)，人的iNOS-rs2297518是幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性胃癌的危險(xiǎn)因素，最終確定iNOS-rs2297518和eNOS-rs2070744的多態(tài)性可能是胃癌的易感因素。有研究表明，iNOS第16外顯子多態(tài)性造成了氨基酸從絲氨酸到亮氨酸的突變[21]，導(dǎo)致iNOS的表達(dá)量增加，促進(jìn)了NO和炎癥的生成，增加了人類(lèi)患非霍奇金淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)，但該位點(diǎn)的突變并未引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，iNOS基因exon 4/intron片段 F4-T11519C和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)分別造成了氨基酸Cys→Arg、Lys→Glu的改變，這可能是造成TT、TC和AA、AG基因型易感布魯菌的重要原因。Dzodzomenyo等[23]對(duì)iNOS多態(tài)性與瘧疾的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)iNOS-954位置攜帶C等位基因的人患嚴(yán)重瘧疾的比例是未攜帶人的2.5倍。這可能是由于iNOS-954攜帶的C等位基因翻譯水平和NOSmRNA表達(dá)量增加，導(dǎo)致NOS表達(dá)量整體上升所致。本試驗(yàn)對(duì)exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron片段的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)哈薩克羊易感布魯菌基因型在exon 2/intron中的F2-C1910T 位點(diǎn)為CC型，在exon 4/intron中的F4-T11519C位點(diǎn)為T(mén)T型和TC型，在F4-A11519G位點(diǎn)為AA型和AG型，在exon 5/intron中的F5-C12707T位點(diǎn)為CC型和CT型，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是各多態(tài)位點(diǎn)等位基因的翻譯水平發(fā)生了改變，造成了iNOS翻譯活性的增加。Merriman等[10]對(duì)iNOS的多態(tài)性與乳腺炎的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)iNOS在乳腺體細(xì)胞中的表達(dá)受脂多糖(LPS)與25-羥基維生素D3相互作用的影響，iNOS的多態(tài)性影響iNOS的表達(dá)及NO的生成，還可能造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。因此，研究iNOS基因與布魯菌易感性對(duì)于哈薩克羊的抗病和育種具有重要的意義。

本研究采用PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)231只哈薩克羊的iNOS基因進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，分析其與布魯菌易感性之間的關(guān)系，結(jié)果表明綿羊iNOS基因存在豐富的多態(tài)性。哈薩克羊iNOS基因F2-C1910T和F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性無(wú)相關(guān)性，而F4-T11519C和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性存在相關(guān)性。RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在最優(yōu)化組合時(shí)，最小自由能最低，也最穩(wěn)定[24]。本研究對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)最小自由能未發(fā)生改變外，其余多態(tài)位點(diǎn)的最小自由能均發(fā)生了不同程度的改變，其中F2-C1910T和F4-T11519C突變導(dǎo)致了RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。F4-T11519C和F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)最小自由能絕對(duì)值都有所降低，這可能是iNOS多態(tài)性在RNA中造成哈薩克羊TT、TC和AA、AG易感布魯菌的重要原因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些多態(tài)位點(diǎn)是否造成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并最終影響了蛋白質(zhì)功能，對(duì)錯(cuò)義多態(tài)位點(diǎn)F4-T11519C和F4-A11546G進(jìn)行了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，這可能是因?yàn)槎鄳B(tài)位點(diǎn)未影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)所致，因此對(duì)于iNOS基因多態(tài)性與布魯菌之間的關(guān)系后續(xù)還需進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié) 論

哈薩克羊iNOS基因exon 2/intron、exon 4/intron、exon 5/intron片段存在多態(tài)位點(diǎn)F2-C1910T、F4-T11519C和F4-A11546G及F5-C12707T。哈薩克羊iNOS基因F2-C1910T和F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性的相關(guān)性不顯著(P>0.05)，F(xiàn)4-T11519C和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性的相關(guān)性極顯著(P<0.01)。哈薩克羊iNOS基因F2-C1910T多態(tài)位點(diǎn)的易感基因型為CC，F(xiàn)4-T11519C多態(tài)位點(diǎn)的易感基因型為T(mén)T、TC，F(xiàn)4-A11519G多態(tài)位點(diǎn)的易感基因型為AA、AG，F(xiàn)5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)的易感基因型為CC、CT。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，除了F4-11546G多態(tài)位點(diǎn)最小自由能未發(fā)生改變外，其余多態(tài)位點(diǎn)的最小自由能均發(fā)生了不同程度的改變，其中F2-C1910T和F4-T11519C多態(tài)位點(diǎn)出現(xiàn)了RNA 結(jié)構(gòu)的改變，F(xiàn)4-T11519C和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)造成了氨基酸的改變，但錯(cuò)義突變均未能造成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。因此，哈薩克羊iNOS基因F2-C1910T和F5-C12707T多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性之間無(wú)相關(guān)性，F(xiàn)4-T11519C和F4-A11546G多態(tài)位點(diǎn)與布魯菌易感性存在相關(guān)性。