王 碩,劉焱琨,夏艷輝,郝鵬輝,王 珂,李洪連,李 宇

(河南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，河南 鄭州 450002)

煙草(Nicotianatabacum)是我國一種重要的經(jīng)濟作物，對國家財政稅收具有十分突出的貢獻[1]。河南省自然條件優(yōu)越，是我國重要的煙葉生產(chǎn)區(qū)[2]。位于河南西南部的南陽，因其突出的區(qū)域優(yōu)勢，為煙草生長提供了優(yōu)越的環(huán)境條件，是河南省重要的煙草種植區(qū)[3]。煙草在生長過程中會受到多種病原物的侵染危害，造成不同程度的經(jīng)濟損失，其中植物寄生線蟲是煙草上重要的病原物之一。

短體屬線蟲(Pratylenchus)是一種遷移性的植物根內(nèi)寄生線蟲，寄主范圍廣泛，現(xiàn)已經(jīng)報道了100多個有效種[4-7]。部分短體線蟲可寄生在煙草根部，造成煙草根組織變褐腐爛，給煙草生產(chǎn)帶來了重大損失[1,8-10]。劉學敏等[9]報道，短體線蟲在吉林煙草種植區(qū)發(fā)生危害，但并未對采集到的線蟲種群進行詳細的鑒定，也未能確定發(fā)生在吉林省煙草上的短體線蟲種類。劉修勇等[11]報道山東省煙草上有落選短體線蟲(P.neglectus)寄生。焦永吉[12]發(fā)現(xiàn)河南省煙草種植區(qū)有桑尼短體線蟲(P.thornei)的發(fā)生危害。李建立等[13]在湖北省煙草上發(fā)現(xiàn)有2種短體線蟲，分別是咖啡短體線蟲和刻痕短體線蟲(P.crenatus)。陳代倩[1]檢測到福建省煙草根部有穿刺短體線蟲(P.penetrans)和咖啡短體線蟲寄生。但上述研究大多集中在對煙草根際線蟲的分離鑒定上，并未對其致病性進行進一步分析。2018年，筆者在河南省南陽市煙草種植區(qū)采集到變褐腐爛的煙株根系，并從中分離到大量短體線蟲,本研究擬采用形態(tài)學和分子生物學相結合的方法對所采集的短體線蟲進行準確鑒定，并利用室內(nèi)盆栽試驗測定其對煙草的致病力，旨在明確河南省南陽市煙草根際短體線蟲的種類及其對煙草的致病性，進而為煙草線蟲病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

在河南省南陽市方城縣清河鄉(xiāng)的煙草大田，采集了5個變褐腐爛的煙株根系樣品。將采集到的病根剪碎后與根際土壤混勻，采用改良的貝曼漏斗法分離樣品中的線蟲[14]。

1.2 短體線蟲的純化培養(yǎng)

在體視顯微鏡下挑取短體線蟲雌蟲，并將單條雌蟲消毒后接種在胡蘿卜愈傷組織上，25 ℃黑暗培養(yǎng)大約70 d[15]，即可得到純化后的短體線蟲種群。

1.3 短體線蟲的形態(tài)學鑒定

體視顯微鏡下挑取短體線蟲，置于凹玻片上的無菌水中，在酒精燈火焰上加熱殺死，快速將殺死的線蟲挑至體積分數(shù)4% FG固定液(V(福爾馬林)∶V(甘油)∶V(蒸餾水)=10∶1∶89)中進行固定，將固定好的線蟲采用甘油-乙醇脫水法脫水，再采用蠟圈法[14]制作永久玻片。使用裝有數(shù)碼相機(Nikon DS-Ri2)和NIS-Elements AR專用軟件的尼康光學顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S)對短體線蟲玻片標本進行形態(tài)觀察、特征值測量并拍照。

1.4 短體線蟲的分子鑒定及系統(tǒng)進化樹構建

參照王江玲等[16]的蛋白酶K法進行單條線蟲DNA提取。rDNA-ITS區(qū)采用通用引物18S (5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26S(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)進行PCR擴增[17]；rDNA 28S D2～D3區(qū)采用通用引物D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)進行PCR擴增[18]。PCR反應體系參照KOD FX DNA聚合酶(Toyobo,日本)說明書配制。PCR反應條件為：94 ℃ 預變性2 min；98 ℃變性10 s，58.2 ℃ (ITS區(qū))或51.7 ℃(28S D2～D3區(qū))退火30 s，68 ℃ 延伸90 s，34個循環(huán)；72 ℃ 終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(Omega,美國)純化回收后，連接至pJET1.2/blunt克隆載體(Thermo Scientific,美國)，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃ 培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆斑于含100 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，經(jīng)菌液PCR驗證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將新獲得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用NCBI上的BLAST程序進行序列相似性分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載短體線蟲rDNA-ITS和rDNA 28S D2～D3區(qū)序列，利用MEGA中的ClustalW方法進行序列比對分析[19]。采用MrModeltest 2.3進行最優(yōu)核苷酸替代模型的選擇。使用MrBayes重建短體線蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹[20]?；趓DNA-ITS和rDNA 28S D2～D3 區(qū)序列分別構建進化樹，參考已發(fā)表的文獻[18,21]選擇外組。

1.5 短體線蟲的致病力測定

將健康飽滿的煙草種子種植于裝有滅菌土的花盆(直徑24 cm)中，每盆3粒，覆土約1 cm，出苗7 d后剔除弱苗，每盆保留長勢一致的單株健壯幼苗。將本研究獲得的供試短體線蟲種群接種在胡蘿卜愈傷組織上，擴繁培養(yǎng)后制成1 000條/mL的短體線蟲懸浮液。煙草種植30 d后，挑選長勢一致的煙草植株接種短體線蟲，每盆接種2 mL，接種量為2 000條/盆，共接種5盆，設置不接種線蟲的煙草作為對照，接種線蟲75 d后，觀察短體線蟲危害煙草的癥狀，測量煙草株高、地上部鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量，分離統(tǒng)計煙草根際的線蟲數(shù)量并計算線蟲的繁殖率(Rf)：Rf=最終分離蟲量/起始接種蟲量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析，對煙草株高、地上部鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量分別采用獨立樣本t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 短體線蟲的種類鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 南陽煙草短體線蟲的形態(tài)測量值見表1。

表1 南陽煙草短體線蟲和咖啡短體線蟲形態(tài)測量值的比較

由圖1-A～I可見，南陽煙草短體線蟲雌蟲熱殺死后蟲體體直或略向腹面彎曲。頭架骨化明顯，唇區(qū)低平、略微縊縮，有2個唇環(huán)。側區(qū)具4條側線?？卺樁檀?、強壯，基部球圓形至橢圓形。中食道球卵圓形，食道腺覆蓋腸前端，覆蓋長度約為體寬的1.2～3.3倍。排泄孔位于半月體后，半月體約2個體環(huán)寬。受精囊明顯，圓形或橢圓形，內(nèi)含精子。尾部近圓柱形，末端光滑窄圓。側尾腺口小，位于尾中部。

由圖1-J～L可知，南陽煙草短體錢蟲雄蟲蟲體前端形態(tài)特征與雌蟲相似。交合刺纖細，長15.4～19.9 μm，引帶長3.8～5.5 μm，交合傘包至尾端，尾較尖。

從上述結果看，本研究中采集到的短體線蟲種群的形態(tài)特征與文獻[22]中咖啡短體線蟲的形態(tài)特征較為一致，故將河南南陽煙草根際采集到的短體線蟲種群初步鑒定為咖啡短體線蟲。

雌蟲(A～I)：A.雌蟲整體,B.雌蟲體前部,C～D.雌蟲頭部(箭頭指示為口針),E.后陰子宮囊,F.受精囊,G.雌蟲側區(qū)側線,H～I.雌蟲尾部；雄蟲(J～L)：J.交合傘,K.交合刺,L.雄蟲整體

2.1.2 分子生物學鑒定 對河南南陽煙草短體線蟲的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增并測序，獲得1條長度為1 249 bp的序列片段(圖2)。在NCBI上進行BLAST分析，顯示本研究獲得的短體線蟲rDNA-ITS區(qū)序列(GenBank登錄號：MN749379)與GenBank數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲rDNA-ITS序列的相似性為93.97%～99.84%。

對河南南陽煙草短體線蟲的rDNA 28S D2～D3區(qū)進行擴增并測序，獲得1條長度為781 bp的序列片段(圖2)。在NCBI上進行BLAST分析，顯示本研究中獲得的短體線蟲rDNA 28S D2～D3區(qū)序列(GenBank登錄號：MN750755),與GenBank數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲種群rDNA 28S D2～D3區(qū)序列的相似性為96.46%～100.00%。

M.DL2000 Marker;1.rDNA-ITS區(qū)擴增產(chǎn)物；2.rDNA 28S D2～D3區(qū)擴增產(chǎn)物

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 基于河南南陽煙草短體線蟲rDNA-ITS區(qū)和rDNA 28S D2～D3區(qū)序列，分別構建系統(tǒng)進化樹。結果(圖3和圖4)顯示，本研究獲得的短體線蟲序列與已報道的咖啡短體線蟲序列形成高度支持的分支(PP=100)。該結果進一步證實，南陽煙草根際的短體線蟲為咖啡短體線蟲。

2.2 咖啡短體線蟲的危害癥狀與致病性

觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，接種咖啡短體線蟲75 d后，接種組煙草植株表現(xiàn)為地上部生長緩慢，植株矮小、長勢弱，葉片出現(xiàn)明顯黃化癥狀。由于咖啡短體線蟲的侵染危害，煙草植株的根系明顯減少、質(zhì)量減輕，出現(xiàn)壞死腐爛癥狀(圖5-A～B)。在咖啡短體線蟲侵染初期，煙草根系出現(xiàn)褐色或紅褐色的侵染病斑(圖5-C)；隨著病情的不斷加重，煙草根系的病斑不斷擴大，出現(xiàn)整條根系壞死腐爛的現(xiàn)象，最終導致整個根系的大面積壞死腐爛(圖5-D～E)。

超過50%的后驗概率顯示在相應的分支上，新獲得的序列加粗顯示。下圖同

圖4 基于rDNA 28S D2～D3序列的南陽煙草短體線蟲的系統(tǒng)進化樹

由表2可知，接種咖啡短體線蟲75 d后，從煙草根部和根際土壤中分離得到大量的咖啡短體線蟲，每株煙草根際平均蟲量達到(11 613±581.09)條，繁殖率(Rf)達到5.81±0.29；接種咖啡短體線蟲組煙草的平均株高為58.54 cm，平均地上部鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量分別為49.50和20.58 g/盆，顯著低于對照組(CK)煙草(其平均株高為75.73 cm，地上部、根的鮮質(zhì)量分別為75.94和27.72 g/盆)(P<0.01)，表明咖啡短體線蟲對煙草具有明顯的致病性。

表2 接種咖啡短體線蟲75 d后的蟲量及其對煙草生長的影響

3 討 論

植物寄生線蟲是煙草的重要病原物之一，據(jù)報道，根結線蟲(Meloidogyne)、短體線蟲、球孢囊線蟲(Globodera)、矮化線蟲(Tylenchorhynchus)等都會侵染危害煙草，并造成一定的經(jīng)濟損失[1,10,23]。此外，長針線蟲屬(Longidorus)、擬長針線蟲屬(Paralongidorus)、毛刺線蟲屬(Trichodorus)、擬毛刺線蟲屬(Paratrichodorus)和劍線蟲屬(Xiphinema)的一些線蟲種類不僅直接危害煙草植株，而且在取食過程中還會傳播某些植物病毒造成更大危害[10,24]。短體線蟲也叫根腐線蟲，國內(nèi)外均有其寄生危害煙草的報道。如在美國北卡羅來納州和津巴布韋均有最短尾短體線蟲(P.brachyurus)寄生危害煙草的報道[25-26]。在加拿大，穿刺短體線蟲是危害煙草的主要線蟲，給煙草生產(chǎn)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，除此之外還有落選短體線蟲寄生危害煙草的報道[26-27]。另外，在美國田納西州也有短體線蟲(Pratylenchusspp.)寄生危害煙草的報道[28]。在國內(nèi)，先后有落選短體線蟲、桑尼短體線蟲、咖啡短體線蟲、刻痕短體線蟲和穿刺短體線蟲等寄生危害煙草的報道[1,9,11-13]。但是國內(nèi)以往對煙草寄生短體線蟲的研究，有些只是普查數(shù)據(jù)，或者僅進行了形態(tài)特征分析，大多缺乏詳細的分子特征分析，也未見有關短體線蟲對煙草致病性的相關研究報道。本研究采用形態(tài)學和分子生物學相結合的方法，對采自河南南陽煙草根際的短體線蟲進行鑒定，明確此短體線蟲種群為咖啡短體線蟲。賀哲等[29]報道，從瑞昌山藥上采集到的咖啡短體線蟲的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲相應ITS序列的相似度為93%～99%，變異達到7%。本研究獲得的咖啡短體線蟲ITS序列(MN749379)與數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲ITS序列的相似性為93.97%～99.84%，變異達到6.03%，在已有文獻[29]報道的咖啡短體線蟲種群ITS的變異范圍以內(nèi)。杜宇等[7]獲得的咖啡短體線蟲D2～D3區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲D2～D3區(qū)序列的相似度為97%～99%，變異達到3%。本研究中獲得的咖啡短體線蟲D2～D3區(qū)序列(MN750755)與GenBank數(shù)據(jù)庫中咖啡短體線蟲相應序列的相似性為96.46%～100.00%，變異達到3.54%，與文獻[7]報道的咖啡短體線蟲的種群內(nèi)變異范圍基本相當。短體線蟲的這種種內(nèi)差異比較常見，特別是ITS序列的種內(nèi)變異較大，這可能與不同種群所處的地理環(huán)境不同有關[30-33]。本研究的室內(nèi)盆栽致病性試驗初步證實，該咖啡短體線蟲種群可對煙草根系造成明顯的危害，會導致根系腐爛而影響煙草的健康生長，明確該短體線蟲種群對煙草具有較強的致病性，這為河南煙草線蟲病害的診斷和防治提供了有效的理論依據(jù)。

河南是我國重要的煙草種植區(qū)，而煙草上另外一種重要病害，即煙草黑脛病在河南的發(fā)生也較為嚴重[34-35]。有研究指出，當最短尾短體線蟲和煙草黑脛病菌共同存在時，短體線蟲侵染造成的傷口能促進煙草黑脛病菌的侵染，從而加重煙草黑脛病的發(fā)病程度[10]。因此，河南省重要煙草種植區(qū)短體線蟲的危害狀況，及當?shù)囟腆w線蟲種群的存在是否會加重煙草黑脛病的發(fā)生，均還有待進一步的調(diào)查和研究。

4 結 論

在河南南陽煙草種植區(qū)煙草植株根際發(fā)現(xiàn)了一種短體線蟲,根據(jù)線蟲的形態(tài)特征和rDNA-ITS、rDNA 28S D2～D3 區(qū)序列特征分析及構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定該短體線蟲為咖啡短體線蟲。經(jīng)室內(nèi)盆栽接種試驗確定，該線蟲能夠侵染危害煙草根系，造成煙草根系腐爛壞死，煙葉黃化萎蔫，對煙草具有明顯的致病性。