馬海浩，陳柯，趙亞男，周翔，王端浩

(成都體育學(xué)院，成都 610041)

腦卒中是全球第三大疾病死亡原因，嚴(yán)重威脅人類的生存與健康。數(shù)據(jù)顯示，2017年我國(guó)農(nóng)村人群腦血管病死亡占居民疾病死亡的比例為23.18%，城市人群為20.52%[1]。運(yùn)動(dòng)作為一種新興的方法可以預(yù)防腦卒中的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，缺乏身體活動(dòng)的男性腦卒中的患病率為28.5%，女性為31.5%，并且患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[2]。Meta分析顯示，適當(dāng)?shù)捏w力活動(dòng)可以降低25%～30%由腦卒中引起的死亡風(fēng)險(xiǎn)[3]。

在腦缺血再灌注后，細(xì)胞外三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，eATP)濃度改變激活嘌呤能受體7(P2X purinoceptor 7，P2RX7)，使細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子大量外流；陽(yáng)離子的外流又使細(xì)胞質(zhì)形成炎性復(fù)合體，炎性復(fù)合體切割下端的天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1)，Caspase-1切割細(xì)胞質(zhì)中的消皮素D(gasdermin D，GSDMD)蛋白，Caspase-1又能切割、加工炎性因子IL-1β和IL-18，使炎性因子通過脹大的細(xì)胞膜孔進(jìn)入細(xì)胞外液。另外，天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶11(cysteinyl aspartate specific proteinase 11，Caspase-11)也能切割GSDMD蛋白，促進(jìn)細(xì)胞膜孔的脹大。本研究探討運(yùn)動(dòng)預(yù)處理在大鼠腦缺血再灌注中對(duì)相關(guān)蛋白的影響及可能機(jī)制，為臨床腦缺血再灌注損傷的運(yùn)動(dòng)治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 大鼠模型制備及實(shí)驗(yàn)分組90只6周齡健康雄性SD大鼠(SPF級(jí))(實(shí)驗(yàn)鼠80只，備用鼠10只)，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于成都體育學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組(40只/組)。非運(yùn)動(dòng)組又進(jìn)一步分為假手術(shù)組(SS組)和模型組(CM組)(20只/組)：SS組大鼠自由活動(dòng)4周，接受假手術(shù)模型制作，線栓插入頸總動(dòng)脈1 cm處，不進(jìn)行缺血再灌注處理；CM組大鼠自由活動(dòng)4周，進(jìn)行大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型制作，2 h后進(jìn)行缺血再灌注處理。運(yùn)動(dòng)組又進(jìn)一步分為單純運(yùn)動(dòng)組(P組)和運(yùn)動(dòng)預(yù)處理模型組(EM組)(20只/組)：P組大鼠在動(dòng)物跑臺(tái)連續(xù)運(yùn)動(dòng)4周后，不進(jìn)行模型制作，直接猝死，斷頭取腦；EM組大鼠在動(dòng)物跑臺(tái)連續(xù)運(yùn)動(dòng)4周后，進(jìn)行MCAO模型制作，2 h后進(jìn)行缺血再灌注處理。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理模型：所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了1周的自適應(yīng)跑步機(jī)訓(xùn)練，跑臺(tái)速度為8～10 m/min，20 min/d，0°斜坡行走。運(yùn)動(dòng)組大鼠接受大鼠跑臺(tái)連續(xù)訓(xùn)練4周，6 d/周，訓(xùn)練方案為30 m/min，30 min/d，0°斜坡，電流刺激強(qiáng)度設(shè)定為1.5 mA；非運(yùn)動(dòng)組中的大鼠在籠中自由活動(dòng)，不使用跑臺(tái)訓(xùn)練[4]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透鶕?jù)Reiss等[5]改良的MCAO線栓法制備。大鼠在造模前12 h禁食不禁水，稱重，按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。將大鼠背位固定在大鼠恒溫手術(shù)臺(tái)上，溫度(37.0±0.5)℃。沿頸部正中皮膚切開約2 cm手術(shù)刀口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。在右側(cè)CCA近心端掛線但不結(jié)扎，用手術(shù)線結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端和CCA下方距分叉1.5 cm處，然后在CCA距離分叉處約0.5 cm處用眼科剪剪“v”型小口，將栓塞線(距離線頭2 cm處用黑色記號(hào)筆標(biāo)記)經(jīng)小口插入CCA，用組織攝輕推栓線進(jìn)入CCA并固定，線栓插入長(zhǎng)度為18～22 mm，微感阻力后停止進(jìn)栓，用細(xì)線結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端。腹腔注射青霉素鈉0.5 mL，手術(shù)切口處滴0.1 mL青霉素鈉。2 h后，抽出栓塞線，完成再灌注后縫合傷口，將大鼠放回籠中。SS組只進(jìn)行麻醉、開口和分離組織等操作，不進(jìn)行栓塞造模。

1.2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在缺血再灌注24 h后處死大鼠，處死前對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分?jǐn)?shù)越高，說明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。首次評(píng)分1、2、3分的大鼠視為造模成功。0分、4分或術(shù)中死亡的大鼠予以剔除，再?gòu)膫溆媒M中隨機(jī)補(bǔ)充。評(píng)分由3位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立完成。(表1)

1.3 紅四唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色深度麻醉動(dòng)物后，迅速斷頭取腦，將腦放進(jìn)大小合適的腦切片模具中，切成1～3 mm厚的切片。將腦片立即置于2%的TTC染色液中，避光孵育、固定、排列、照相、計(jì)算腦梗死面積的大小。腦梗死面積計(jì)算公式：腦梗死面積百分比=腦片總梗死面積/對(duì)側(cè)腦片總面積×100%。

表1 Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 蘇木精-伊紅 ( hematoxylin-eosin，HE )染色固定組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水、包埋、切片后進(jìn)行蘇木精染色；橫切組織，切片厚5 μm；經(jīng)脫蠟、水化、染色、脫水、透明、封片等步驟后在鏡下拍照。

1.5 ELISA檢測(cè)血清IL-1β和IL-18水平取血后，以1 510×g離心15 min，分離血清。然后用ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D公司)分別檢測(cè)各組大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的水平。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白將大鼠腦樣本放入EP管中，加入RIPA裂解液剪碎，于冰上裂解10 min；收集裂解液，4 ℃、24 170×g離心10 min，取上清液，進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育[一抗：Caspase-1(武漢三鷹公司)，1∶1 000；GSDMDC1(Santa Cruz公司)，1∶500；P2RX7(武漢博士德公司)，1∶100；Caspase-11(Santa Cruz公司)，1∶300；β-actin，1∶5 000。將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜放入一抗中，4 ℃孵育過夜]；用TBST將PVDF膜洗3次，進(jìn)行二抗孵育[將PVDF膜放入二抗(1∶5 000)中，在搖床上輕搖，室溫孵育2～3 h]；用TBST將PVDF膜洗3次，最后顯影、定影，進(jìn)行圖像分析，得出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量的變化所有大鼠在進(jìn)行MCAO前體質(zhì)量控制在250～280 g，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。4組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠Longa評(píng)分的比較MCAO 24 h后，SS組和P組大鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)；CM組和EM組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)，與SS組和P組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EM組與CM組比較，大鼠神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)減輕 (P<0.05)。(表2)

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的比較

2.3 各組大鼠腦TTC染色及腦梗死面積的比較MCAO 24 h后，SS組和P組大鼠均未出現(xiàn)腦梗死灶；CM組和EM組大鼠腦組織均出現(xiàn)不同程度的梗死灶，與SS組和P組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EM組與CM組比較，腦梗死面積縮小 (P<0.05)。(表3、圖1)

表3 各組大鼠腦梗死面積的比較

圖1 各組大鼠腦梗死面積

2.4 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶HE染色結(jié)果光鏡下(×100、×400)觀察，SS組和P組大鼠皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)和軟腦膜完整、清晰，各細(xì)胞層排列較為整齊，神經(jīng)元形態(tài)正常，未見明顯變性或壞死。CM組腦組織大面積梗死，神經(jīng)元呈片狀壞死并伴隨水腫，細(xì)胞崩解，梗死區(qū)邊緣神經(jīng)元空泡變性或點(diǎn)狀壞死。EM組腦組織出現(xiàn)梗死，部分神經(jīng)元細(xì)胞壞死并伴隨水腫，梗死區(qū)邊緣神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為正常，神經(jīng)纖維排列致密，染色較為均勻。(圖2)

注：A.SS組(HE，×100)；B.SS組(HE，×400)；C.P組(HE，×100)；D.P組(HE，×400)；E.CM組(HE，×100)；F.CM組(HE，×400)；G.EM組(HE，×100)；H.EM組(HE，×400)。圖2 各組大鼠大腦皮層HE染色結(jié)果

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平的比較CM組、EM組與SS組比較，血清IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.01)；與CM組比較，EM組血清IL-1β、IL-18水平明顯降低(P<0.01)。(圖3)

2.6 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白水平的比較MCAO 24 h后，與SS組和P組比較，CM組P2RX7蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與CM組比較，EM組P2RX7蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。(圖4)

注：與SS組比較，*P<0.01；與CM組比較，#P<0.01。圖3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平的比較

注：A. P2RX7蛋白相對(duì)表達(dá)水平；B.P2RX7 Western blotting蛋白電泳條帶。與SS組比較，*P<0.05，**P<0.01；與P組比較，#P<0.01；與CM組比較，△P<0.01。圖4 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶P2RX7蛋白表達(dá)水平的比較

MCAO 24 h后，與SS組比較，P組Caspase-11蛋白表達(dá)相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SS組和P組比較，CM組Caspase-11蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CM組比較，EM組Caspase-11蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。(圖5)

MCAO 24 h后，與SS組比較，P組Caspase-1蛋白表達(dá)相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SS組和P組比較，CM組Caspase-1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CM組比較，EM組Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。(圖6)

MCAO 24 h后，與SS組比較，P組GSDMD蛋白表達(dá)相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SS組和P組比較，CM組GSDMD蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CM組比較，EM組GSDMD蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。(圖7)

注：A. Caspase-11蛋白相對(duì)表達(dá)水平；B.Caspase-11 Western blotting蛋白電泳條帶；與SS組比較，*P<0.05，**P<0.01；與P組比較，#P<0.05，##P<0.01；與CM組比較，△P<0.05。圖5 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶Caspase-11蛋白表達(dá)水平的比較

注：A. Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平；B.Caspase-1 Western blotting蛋白電泳條帶。與SS組比較，* P<0.05，**P<0.01；與P組比較，#P<0.01；與CM組比較，△P<0.01。圖6 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶Caspase-1蛋白表達(dá)水平的比較

注：A.GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)水平；B.GSDMD Western blotting蛋白電泳條帶。與SS組比較，*P<0.01；與P組比較，#P<0.01；與CM組比較，△P<0.01。圖7 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶GSDMD蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

HE染色結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷在病理學(xué)方面有預(yù)防作用，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的大鼠在腦缺血術(shù)后，組織細(xì)胞對(duì)缺氧、缺血的耐受性增加；腦梗死面積減小可能是因?yàn)樵俟嘧⒑?，半暗帶的?xì)胞得到了一部分血液與氧的供應(yīng)，細(xì)胞能繼續(xù)存活。TTC染色結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理后的大鼠腦梗死面積較小，且神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)減輕，這提示腦梗死面積與神經(jīng)學(xué)評(píng)分有關(guān)聯(lián)。

Ding等[6]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理后不進(jìn)行腦缺血再灌注，大鼠TNF-αmRNA和細(xì)胞間黏附因子1的表達(dá)水平隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加而增加，這提示運(yùn)動(dòng)可能增加炎性因子的表達(dá)。本研究中，在缺血再灌注處理后，相關(guān)炎性因子的表達(dá)明顯減少，這可能與炎性因子不同有關(guān)，也可能與假手術(shù)有關(guān)，假手術(shù)產(chǎn)生創(chuàng)傷也可能增加炎性因子的表達(dá)。另外，Comassi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，正常安靜狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)員血清IL-1β和IL-18水平顯著高于體力活動(dòng)不足者；一次運(yùn)動(dòng)后，體力活動(dòng)不足者血清IL-1β水平升高，但運(yùn)動(dòng)員血清IL-1β水平下降，IL-18水平明顯下降，說明運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可增加IL-1β和IL-18促炎因子或相關(guān)蛋白的表達(dá)，長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體可能對(duì)單次運(yùn)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生了適應(yīng)，血清IL-1β、IL-18水平下降可能與機(jī)體對(duì)應(yīng)激耐受的提高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，P組大鼠血清IL-1β、IL-18水平與SS組比較，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與運(yùn)動(dòng)時(shí)間或運(yùn)動(dòng)周期有關(guān)；而EM組與CM組比較，血清IL-1β、IL-18水平明顯降低，這提示經(jīng)過運(yùn)動(dòng)預(yù)處理后機(jī)體可能對(duì)應(yīng)激刺激做出了適應(yīng)。本研究中，MCAO后大鼠血清炎性因子IL-1β和IL-18水平升高，提示IL-1β和IL-18可能是與正常細(xì)胞的細(xì)胞膜受體IL-1R和IL-18受體結(jié)合，促使細(xì)胞通路激活。IL-1β的分泌可能存在其他機(jī)制，在中性粒細(xì)胞和人單核細(xì)胞中，IL-1β可以在沒有焦磷酸作用的情況下釋放[8]。另外，IL-18與IL-18受體結(jié)合并發(fā)出信號(hào)，在NK細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ分泌，從而使Th1發(fā)生炎癥反應(yīng)，在退行性神經(jīng)疾病中，IFN-β/IL-1β軸的活化可能對(duì)疾病產(chǎn)生影響[9]。Kaiser等[10]研究發(fā)現(xiàn)，P2RX7-/-小鼠在MCAO后腦水腫更加明顯，并伴隨著更嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷。但Ye等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦缺血再灌注后，P2RX7、Caspase-1在缺血腦組織中的表達(dá)顯著增加，給予P2RX7抑制劑注射后，小鼠缺血性腦組織中的P2RX7蛋白表達(dá)水平降低且腦梗死面積減少，腦卒中后的功能得到改善。本研究中，CM組大鼠腦組織P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白顯著升高，提示缺血性腦卒中會(huì)激活炎癥小體活化通路。Young等[12]研究發(fā)現(xiàn)，eATP濃度升高，細(xì)胞膜上的離子通道打開，ATP大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)K+大量外流，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞興奮性毒性增加，這不利于細(xì)胞的存活。有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-11非經(jīng)典炎癥小體激活的2個(gè)標(biāo)志是IL-1β和IL-18的分泌及磷酸化[13]。目前認(rèn)為，Caspase-11可能通過炎癥小體或直接調(diào)控Caspase-1蛋白增加Caspase-1蛋白的表達(dá)[14]。本研究中，CM組血清IL-1β和IL-18水平明顯增加，EM組血清IL-1β和IL-18水平明顯下降，趨勢(shì)與Caspase-11蛋白表達(dá)一致，這提示P2RX7、Caspase-11可能是Caspase-1的上游蛋白，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可能增加了腦組織在缺血、缺氧情況下的組織耐受，降低Caspase-11蛋白的表達(dá)，減少炎性小體的形成和GSDMD的表達(dá)。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后3 h注射Caspase-1抑制劑可對(duì)大鼠MCAO后海馬區(qū)域提供神經(jīng)保護(hù)作用，小鼠MCAO造模后30 min內(nèi)神經(jīng)元Caspase-1被迅速激活。GSDMD作為Caspase-1的底物，在腦缺血再灌注后表達(dá)升高，GSDMD的過表達(dá)可以提高IL-1β和IL-18的水平[16]。Yi[17]研究發(fā)現(xiàn)，從GSDMD-/-小鼠分離的巨噬細(xì)胞，在受到LPS和細(xì)菌感染時(shí)不會(huì)發(fā)生細(xì)胞焦亡，炎性因子IL-1β分泌減少，并且對(duì)LPS誘導(dǎo)的感染產(chǎn)生抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO后GSDMD蛋白的表達(dá)變化可能是上游蛋白表達(dá)升高所致，Caspase-1、Caspase-11等蛋白表達(dá)的增加都會(huì)導(dǎo)致GSDMD蛋白表達(dá)的增加。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，4周運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可改善大鼠腦缺血再灌注后的梗死面積、細(xì)胞壞死和神經(jīng)功能損傷，對(duì)腦組織和神經(jīng)元具有保護(hù)作用，同時(shí)可減少大鼠腦缺血再灌注損傷后P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白的表達(dá)，減少大鼠腦缺血再灌注后血清IL-1β、IL-18的含量，降低炎癥水平。本研究結(jié)果為防治缺血性腦卒中提供了理論線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。