廖偉榮，葉衛(wèi)平

(臺州市中醫(yī)院 兒科，臺州 318000)

哮喘是由于細支氣管平滑肌痙攣及不同程度的黏膜水腫、分泌亢進引起的過敏性疾病，也是兒童最常見的慢性氣道炎癥性疾病[1-2]。目前，兒童哮喘總體控制水平仍不理想，故探索與兒童哮喘發(fā)生和發(fā)展相關的標志物具有深遠意義[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA核富集轉(zhuǎn)錄體1(long non-coding RNA nuclear enriched abundant transcript 1， lnc-NEAT1)在膿毒癥和SLE等疾病中發(fā)揮著重要作用[3-6]，miR-124在膿毒癥和急性肺損傷小鼠模型中可降低炎癥水平[3，7-9]。鑒于lnc-NEAT1和miR-124均在炎癥性疾病及肺部疾病中發(fā)揮重要作用，且miR-124是lnc-NEAT1的靶向基因之一[7-9]，推測lnc-NEAT1可能通過調(diào)節(jié)miR-124參與兒童哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程，但目前尚未見相關報道。本研究旨在評估lnc-NEAT1/miR-124軸對兒童哮喘急性發(fā)作風險的預測作用，并探索其與疾病嚴重程度及炎癥的關聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究連續(xù)納入2016年3月至2018年2月臺州市中醫(yī)院收治的急性發(fā)作期哮喘患兒95例(輕度25例、中度52例、重度18例)、緩解期哮喘患兒95例。所有入組哮喘患兒均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]的診斷標準，且年齡均<16歲。急性發(fā)作期定義為突然發(fā)生喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀或原有癥狀急劇加重；緩解期定義為經(jīng)過治療或未經(jīng)治療癥狀、體征消失，肺功能恢復到急性發(fā)作前水平，并維持3個月以上。在急性發(fā)作期和緩解期哮喘患兒中有合并嚴重感染、血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤者予以排除。同期納入90例在臺州市中醫(yī)院進行健康體檢且體檢指標無異常的兒童作為健康對照。健康對照兒童入組需滿足：年齡、性別等基本人口學資料與哮喘患兒匹配，無哮喘及其他過敏性疾病史，無感染、血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤。3組受試者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、家族哮喘病史等差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。本研究經(jīng)臺州市中醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者及其法定監(jiān)護人在研究開始前均已簽署知情同意書。

表1 研究對象的一般資料

1.2 肺通氣功能檢測及疾病嚴重程度評估哮喘患兒于入院或門診當日進行肺部通氣功能檢測，健康兒童于體檢時進行肺部通氣功能檢測。肺部通氣功能檢測包括第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1)和用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)，并分別計算FEV1與FVC之比(FEV1/FVC)及FEV1與正常預計值之比(FEV1%預計值)。同時，根據(jù)哮喘急性發(fā)作時的癥狀、體征、肺功能及血氧飽和度等情況，參考《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]評估急性發(fā)作期哮喘患兒疾病的嚴重程度。

1.3 血液樣本采集與處理所有受試者入組后采集外周靜脈血于抗凝管中，并在收集后1 h內(nèi)離心分離血漿。離心分離條件：樣本在4 ℃以1 600×g離心10 min，吸取上清液，再在4 ℃以16 000×g離心10 min，分離得到血漿。將血漿樣本轉(zhuǎn)移至凍存管中，—80 ℃保存，待后續(xù)檢測。血漿樣本中l(wèi)nc-NEAT1和miR-124的相對表達量采用實時熒光定量PCR檢測，炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17)采用ELISA檢測。

1.4 ELISA檢測采用ELISA試劑盒(Abcam公司)按照操作說明進行檢測。簡要流程：首先向預包被抗體的96孔板中加入樣本，孵育，然后用封閉液進行封閉，再加入第2個抗體稀釋液進行孵育。經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色后，用酶標儀(Biotek公司)在450 nm處讀數(shù)。

1.5 實時熒光定量PCR檢測采用TRIzol(Invitrogen公司)從血漿中提取總RNA，然后用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒(Bio-Rad公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用THUNDERBIRD?SYBR?qPCR Mix試劑盒(Toyobo公司)完成實時熒光定量PCR檢測。以GAPDH和U6分別作為lnc-NEAT1和miR-124的參照物，采用2-△△Ct法計算lnc-NEAT1和miR-124的相對表達量。(表2)

表2 實時熒光定量PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸在急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒和健康兒童中的表達水平及ROC曲線與健康兒童比較，lnc-NEAT1及l(fā)nc-NEAT1/miR-124軸在急性發(fā)作期哮喘患兒和緩解期哮喘患兒中均呈現(xiàn)較高的表達(P<0.05)，且在急性發(fā)作期哮喘患兒中的表達高于緩解期哮喘患兒(P<0.001)。ROC曲線顯示，lnc-NEAT1、miR-124及l(fā)nc-NEAT1/miR-124軸可以很好地區(qū)分急性發(fā)作期哮喘患兒與健康兒童以及急性發(fā)作期哮喘患兒與緩解期哮喘患兒，且與單獨的lnc-NEAT1或miR-124比較，lnc-NEAT1/miR-124軸具有更強的預測價值。(圖1)

注：CI為可信區(qū)間(confidence interval)。圖1 lnc-NEAT1、miR-124、lnc-NEAT1/miR-124軸在3組受試者中的水平比較及ROC曲線分析

2.2 lnc-NEAT1表達量與miR-124表達量在急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒和健康兒童中的關聯(lián)lnc-NEAT1表達量與miR-124表達量在急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒和健康兒童中均呈負相關(r=-0.338，P=0.001；r=-0.290，P=0.004；r=-0.316，P=0.002)。

2.3 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與嗜酸性粒細胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1%預計值在急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒和健康兒童中的關聯(lián)急性發(fā)作期哮喘患兒的lnc-NEAT1表達量與FEV1/FVC和FEV1%預計值均呈負相關(r=-0.288，P=0.005；r=-0.296，P=0.004)。急性發(fā)作期哮喘患兒的miR-124表達量與FEV1/FVC和FEV1%預計值均呈正相關(r=0.473，P<0.001；r=0.469，P<0.001)，而在健康兒童中，miR-124表達量與FEV1/FVC呈正相關(r=0.240，P=0.023)。此外，急性發(fā)作期哮喘患兒的lnc-NEAT1/miR-124軸表達量與FEV1/FVC和FEV1%預計值均呈負相關(r=-0.495，P<0.001；r=-0.465，P<0.001)。(表3)

2.4 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與炎性因子在急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒和健康兒童中的關聯(lián)急性發(fā)作期哮喘患兒及緩解期哮喘患兒的lnc-NEAT1表達量與TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈正相關(P<0.05)，健康兒童的lnc-NEAT1表達量與TNF-α、IL-6和IL-17水平呈正相關(P<0.05)。急性發(fā)作期哮喘患兒的miR-124表達量與TNF-α和IL-1β水平呈負相關(P<0.05)，健康兒童的miR-124表達量與TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈負相關(P<0.05)。急性發(fā)作期哮喘患兒、緩解期哮喘患兒及健康兒童的lnc-NEAT1/miR-124軸表達量與TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈正相關(P<0.05)。(表4)

表3 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與嗜酸性粒細胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1%預計值的關聯(lián)[r值(P值)]

表4 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與炎性因子的關聯(lián)[r值(P值)]

2.5 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與急性發(fā)作期哮喘患兒疾病嚴重程度的關聯(lián)將急性發(fā)作期哮喘患兒按照疾病嚴重程度分為輕度、中度和重度。結(jié)果顯示，lnc-NEAT1高表達與較重的急性發(fā)作期哮喘有關聯(lián)，而miR-124高表達與較輕的急性發(fā)作期哮喘有關聯(lián)，lnc-NEAT1/miR-124軸高表達與較重的急性發(fā)作期哮喘有關聯(lián)。(表5)

表5 急性發(fā)作期哮喘患兒lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124軸與疾病嚴重程度的關聯(lián)[M (P25～P75)]

3 討論

lnc-NEAT1可參與多種生物學過程，尤其是炎癥性疾病的病理機制[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-NEAT1在慢性壓迫性損傷小鼠模型的脊髓中過表達，且其下調(diào)可降低炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平[11]。lnc-NEAT1對一些炎癥性疾病(如SLE及膿毒癥)的發(fā)生有預測價值[5-6]，然而關于lnc-NEAT1在肺部炎癥性疾病中的臨床研究報道較少。有一篇研究表明，lnc-NEAT1在有吸煙史的慢性阻塞性肺疾病患者中表達量相比無吸煙史的慢性阻塞性肺疾病患者高[13]。鑒于lnc-NEAT1在多種炎癥性疾病及肺部疾病中均發(fā)揮重要作用，推測lnc-NEAT1可能也影響哮喘患兒的疾病嚴重程度或炎癥水平，然而尚未見有關報道。本研究納入了急性發(fā)作期哮喘患兒和緩解期哮喘患兒各95例以及健康對照兒童90例，檢測其外周血樣本中的lnc-NEAT1表達水平，結(jié)果顯示，lnc-NEAT1在急性發(fā)作期哮喘患兒中的表達量明顯高于健康兒童和緩解期哮喘患兒，且ROC曲線表明lnc-NEAT1可以很好地預測兒童哮喘急性發(fā)作的風險，這可能是由于lnc-NEAT1促進了炎癥級聯(lián)反應，從而致使內(nèi)膜發(fā)生病理性變化，進而導致哮喘的發(fā)生[12]。此外，以往研究中尚未見關于lnc-NEAT1與兒童哮喘嚴重程度和炎癥水平的報道[5-6]。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期哮喘患兒lnc-NEAT1表達量與肺通氣功能呈負相關而與疾病嚴重程度呈正相關，且在急性發(fā)作期哮喘及緩解期哮喘患兒中，lnc-NEAT1表達量與炎性因子水平呈正相關?？赡艿脑蚴牵?1)lnc-NEAT1促進了炎性因子的釋放和過多的黏液分泌，加重了氣流阻塞，因此影響了FEV1/FVC、FEV1%預計值及疾病嚴重程度[4，14]；(2)lnc-NEAT1通過增加活性氧而造成免疫系統(tǒng)過度激活的狀態(tài)，從而提高炎性因子水平[15]。

miRNA已被證實參與了生物體的生長、發(fā)育和疾病發(fā)生等重要過程[16-17]。其中，miR-124對多種疾病(包括肺部疾病)的炎癥反應起到抑制作用[7，18]。如miR-124在膿毒癥小鼠模型中降低了血漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，亦在LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型中減弱炎癥反應[7，18-19]。然而關于miR-124在兒童哮喘中的作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，miR-124對兒童哮喘急性發(fā)作的風險有較高的預測價值，急性發(fā)作期哮喘患兒miR-124表達量與肺部通氣功能呈正相關而與疾病嚴重程度呈負相關，且在急性發(fā)作期哮喘及緩解期哮喘患兒，miR-124表達量與炎性因子水平呈負相關。

考慮到lnc-NEAT1與多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，而miR-124對多種疾病尤其是肺損傷的炎癥反應起到抑制作用，此外miR-124是受lnc-NEAT1調(diào)節(jié)的基因之一，猜測lnc-NEAT1可能通過調(diào)節(jié)miR-124而影響兒童哮喘的發(fā)生、發(fā)展，嚴重程度和炎性因子水平[7-9]。然而，關于lnc-NEAT1和miR-124在兒童哮喘中的作用尚未見報道。本研究評估了lnc-NEAT1與miR-124表達量的關聯(lián)，并且進一步評價了lnc-NEAT1/miR-124軸在急性發(fā)作期和緩解期哮喘患兒中與疾病發(fā)生、嚴重程度及炎性因子的關系。結(jié)果顯示，lnc-NEAT1與miR-124呈負相關，且lnc-NEAT1/miR-124軸可以很好地預測兒童哮喘急性發(fā)作的風險，其高表達與急性發(fā)作期哮喘患兒的弱肺部通氣功能、高疾病嚴重程度和高炎性因子水平相關，也與緩解期哮喘患兒的高炎性因子水平相關。同時，lnc-NEAT1/miR-124軸相比lnc-NEAT1或miR-124在數(shù)值上具有更大的預測兒童哮喘急性發(fā)作風險的價值。以上結(jié)果說明，lnc-NEAT1/miR-124軸可以作為一項標志物來預測兒童哮喘急性發(fā)作的風險，監(jiān)測疾病嚴重程度。

本研究仍有不足之處：(1)僅納入急性發(fā)作期哮喘患兒95例、緩解期哮喘患兒95例以及健康對照兒童90例，各組樣本量相對較小，這可能會導致統(tǒng)計效能較低；(2)本研究為單中心研究，研究結(jié)果可能缺乏廣泛的代表性；(3)lnc-NEAT1在兒童哮喘發(fā)生和發(fā)展中的分子機制以及l(fā)nc-NEAT1/miR-124軸的具體作用尚不明確。因此，非常有必要開展更大樣本量的和多中心的研究來驗證本研究的結(jié)果。同時，有必要進一步探索lnc-NEAT1/miR-124軸在兒童哮喘中的作用機制。

綜上所述，循環(huán)lnc-NEAT1/miR-124軸在哮喘患兒中呈高表達，可預測兒童哮喘急性發(fā)作的風險，且其高表達與急性發(fā)作期哮喘患兒的肺部通氣功能呈負相關，與疾病嚴重程度和炎癥水平呈正相關，表明lnc-NEAT1/miR-124軸可作為預測兒童哮喘急性發(fā)作風險和監(jiān)測疾病嚴重程度的潛在標志物。