張 玲，宿冬遠(yuǎn)，姜 政

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)WHO統(tǒng)計結(jié)果顯示，亞洲范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率居全球惡性腫瘤發(fā)生率的第7位，病死率在10%左右[1-2]。在我國胃癌的發(fā)病率僅次于第1位的肺癌，由于早期胃癌無明顯癥狀，多數(shù)患者初診時已為晚期，而晚期胃癌患者多伴隨淋巴或血液轉(zhuǎn)移，往往預(yù)后較差[3]，因此針對胃癌侵襲能力及預(yù)后生物標(biāo)志物的篩選研究成為熱點方向之一。機(jī)體的免疫系統(tǒng)通過識別并殺傷腫瘤細(xì)胞來阻止腫瘤發(fā)生進(jìn)展的這一過程被稱為免疫監(jiān)視[4]，雖然大多數(shù)的腫瘤抗原具有免疫原性，但機(jī)體的免疫系統(tǒng)并不能完全有效的祛除腫瘤細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)[5]。

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte angigen，HLA)是參與內(nèi)源性抗原肽加工、處理及提呈的重要抗原[6]。目前研究證實HLA-I表達(dá)的降低或缺失會使得HLA-I向T細(xì)胞呈遞的抗原多肽無法被細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視繼續(xù)發(fā)展[7]。但胃癌中HLA-I與免疫活性細(xì)胞反應(yīng)及預(yù)后之間的相關(guān)研究鮮少報道，因此本研究通過免疫組化檢測胃癌組織中HLA-I及微環(huán)境中免疫活性細(xì)胞浸潤情況，來分析HLI-I與免疫活性細(xì)胞反應(yīng)及預(yù)后之間的關(guān)系，探討HLA-I在胃癌發(fā)生中的作用。

1 資料和方法

1.1臨床資料 收集本院2014年12月—2016年12月期間胃腸外科、消化科及腫瘤科胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織石蠟標(biāo)本80例為癌組織組，并取同期非胃癌胃破裂穿孔患者的正常胃組織石蠟標(biāo)本80例為正常胃組織組。胃癌組織組患者均經(jīng)資深病理科醫(yī)師閱片后確診；男56例，女24例；年齡43～75(57.3±7.2)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期35例，Ⅲ/Ⅳ期45例。正常胃組織組男52例，女28例；年齡40～73(55.6±6.8)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要試劑：HLA-I鼠抗人單克隆抗體(1∶100)購自日本MBL公司；兔抗人CD11c單克隆抗體(1∶200)購自英國abcam公司，用于標(biāo)記樹突狀細(xì)胞；即用型鼠抗人CD45 RO、CD8單克隆抗體購自邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，分別用于標(biāo)記記憶性T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；羊抗鼠和兔二抗，DAB顯色液均購自邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2.2免疫組化：將固定好的胃癌組織及正常胃組織制成切片。將制好的切片放入60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h完成脫水、脫蠟及抗原修復(fù)之后，用50 ml的3%過氧化氫洗滌，放入37℃烤箱中烘干25 min，PBS漂洗3次，每次5 min，分別加入一抗4℃過夜，次日室溫復(fù)溫20 min后用PBS漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃條件下孵育30 min，加入適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后，繼續(xù)加入蘇木素復(fù)染10 min，流水下洗凈，二甲苯脫水透明后加入中性樹膠封片，鏡檢。以試劑盒提供的已知陽性表達(dá)切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：所有閱片均由兩位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲法評估結(jié)果。具體方法為每張切片400倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，并在視野上計數(shù)100個細(xì)胞，首先觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度，無變色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；接著計算陽性細(xì)胞百分比，<10%為0分，10%～20%為1分，21%～50%為2分，>50%為3分。取2項評分的乘積記為每個標(biāo)本的染色積分，積分<3分判定為陰性，≥3分判定為陽性。

1.3隨訪 患者自手術(shù)切除后開始門診復(fù)查或電話隨訪，治療后1年內(nèi)每3個月門診復(fù)查1次，2年內(nèi)半年復(fù)查1次，以后至少每年復(fù)查一次。隨訪記錄生存時間及隨訪時狀態(tài)(存活、死亡或其他)。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織及正常胃組織中HLA-I及免疫活性細(xì)胞表達(dá)情況 胃癌組織組HLA-I、CD11c+樹突狀細(xì)胞、CD45RO+記憶性T細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)率均低于正常胃組織組(P<0.01)。見表1。

表1 胃癌組織及正常胃組織中HLA-I及免疫活性細(xì)胞陽性表達(dá)情況[例(%)]

2.2HLA-I表達(dá)水平與臨床病理特征及免疫活性細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)性 胃癌組織中HLA-I的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、CD11c+樹突狀細(xì)胞、CD45RO+記憶性T細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 HLA-I表達(dá)水平與臨床病理特征及免疫活性細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)性[例(%)]

2.3單因素分析 80例胃癌患者術(shù)后隨訪時間為3.8～61.5個月，中位隨訪時間為28.7個月，3年內(nèi)無病生存率為53.75%(43/80)。單因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、腫瘤直徑≥4 cm、3種免疫活性細(xì)胞陰性表達(dá)、HLA-I陰性表達(dá)均是胃癌患者預(yù)后生存的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌患者預(yù)后生存的單因素分析

2.4胃癌患者預(yù)后生存的多因素Cox回歸分析 多因素Cox生存分析模型分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ/Ⅳ期、3種免疫活性細(xì)胞陰性表達(dá)、HAL-I陰性表達(dá)是胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 胃癌患者預(yù)后生存的多因素Cox回歸分析

3 討論

機(jī)體抗腫瘤機(jī)制主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作為特異性消除癌細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞，需識別腫瘤細(xì)胞表面具有免疫活性的不同類型HLA-I類分子才能殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。HLA-I類分子表達(dá)降低或者缺失均會導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識別功能異常，從而使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[9]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織組HLA-I的陽性表達(dá)水平顯著降低，且胃癌微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的陽性表達(dá)水平也顯著降低，這提示機(jī)體的免疫功能對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)無能，這一過程可能與HLA-I介導(dǎo)的免疫逃逸關(guān)系密切。Park等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-I類分子作為所有有核細(xì)胞上的可被CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別的肽抗原，在Ⅱ、Ⅲ期胃癌患者中的陽性表達(dá)率僅為34.7%和40.5%，并且HLA-I陰性表達(dá)與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HLA-I表達(dá)水平與樹突狀細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞表達(dá)相關(guān)。樹突狀細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，對維持T細(xì)胞的記憶功能是必需的[11]，而胃癌組織中低表達(dá)情況可能是因為HLA-I類分子的表達(dá)受到多種參與抗原加工提呈過程的相關(guān)蛋白影響，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)被降解的多肽無法有效的提呈給HLA-I類分子，影響到細(xì)胞膜上表達(dá)的密度及穩(wěn)定性，從而無法被CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別[12]，另外非經(jīng)典的HLA-I類基因也會抑制NK和T細(xì)胞的功能進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避機(jī)制[13]。

本研究結(jié)果顯示，HLA-I在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化水平、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期患者癌組織中表達(dá)水平顯著降低，提示HLA-I可能在胃癌的發(fā)生早期及整個進(jìn)展過程中均發(fā)揮著重要的作用，并且能夠在一定程度反映出胃癌的惡性程度，而惡性程度越高可能患者的預(yù)后也越差。通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤直徑≥4 cm、3種免疫活性細(xì)胞陰性表達(dá)、HAL-I陰性表達(dá)是胃癌患者預(yù)后的影響因素。有研究認(rèn)為，腫瘤局部浸潤的記憶性T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞越多，患者的無瘤生存率也越高[14-15]，可能是當(dāng)腫瘤微環(huán)境中免疫活性細(xì)胞反應(yīng)較強(qiáng)，異常表達(dá)的相關(guān)蛋白能夠被快速的識別并破壞，同時也能夠破壞侵入至淋巴結(jié)中的腫瘤細(xì)胞，阻止癌細(xì)胞的發(fā)展，同時較高水平的HLA-I表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞表面的HLA-I類復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，呈遞的抗原肽更容易被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識別而殺傷癌細(xì)胞，阻止癌細(xì)胞的發(fā)展[16]。多因素Cox生存分析模型分析也進(jìn)一步證實了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、3種免疫活性細(xì)胞陰性表達(dá)、HAL-I陰性表達(dá)是胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，HAL-I類分子作為腫瘤抗原肽呈遞的關(guān)鍵分子，其表達(dá)降低會引起胃癌局部微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞浸潤減少，致使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，躲避殺傷，從而向淋巴結(jié)或其他部位轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，因此通過提高腫瘤細(xì)胞表面HLA-I表達(dá)情況，增強(qiáng)腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答可能是靶向治療的方向之一。但本研究樣本量較小，還需要擴(kuò)大病例數(shù)做進(jìn)一步研究。