齊英凱，楊 波，尤 瑩，聶 宇，張 康

（1.滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北滄州 061000； 2.承德市中心醫(yī)院）

據(jù)研究顯示，全球每年有超過20億人需要手術(shù)治療，術(shù)中常用異氟醚進(jìn)行麻醉，是最常用的吸入麻醉藥之一[1]，然而，最新的研究表明，異氟醚具有神經(jīng)毒性，增加神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)發(fā)育，尤其是與患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙有關(guān)[2-4]。因此，尋找能夠有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)這些神經(jīng)毒性作用的藥物尤為重要。據(jù)研究顯示類黃酮類化合物牡荊素可以降低血壓和脂質(zhì)過氧化作用，并增加冠狀動(dòng)脈血流量，從而對(duì)心肌缺血性損傷具有保護(hù)作用，還會(huì)抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生[5,6]。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)牡荊素對(duì)異氟醚誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用[7]，但具體的保護(hù)機(jī)制并未完全闡明， 因此本研究用異氟醚誘導(dǎo)SD大鼠神經(jīng)損傷模型，探索牡荊素可能的保護(hù)機(jī)制，本研究可能會(huì)對(duì)異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供新見解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

50只雄性SD大鼠（200～250 g）從中國滄州市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得，在12h光照/12h黑暗以及恒定的室溫（21±2°C）下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。牡荊素（西安昊軒生物科技，批號(hào)：2018030）；異氟醚（Baxter，美國）；miRNA提取試劑盒（Sigma-Aldrich，美國）；TUNEL試劑盒（武漢博士德公司）；Morris水迷宮（成都泰盟軟件有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立及干預(yù)方法 將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只：模型組，牡荊素低、中、高劑量組及對(duì)照組。對(duì)照組，正常喂養(yǎng)，不做處理；模型組，牡荊素低、中、高劑量組均置于麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)吸入2%異氟醚與氧氣的混合氣體2h，牡荊素低、中、高劑量組分別靜脈注射給以牡荊素：1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg。牡荊素溶于生理鹽水，每只大鼠每次尾靜脈注射1ml，每天1次，連續(xù)治療14d。模型組大鼠尾靜脈注射給以等體積生理鹽水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 給藥結(jié)束后，用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶測試。Morris水迷宮的直徑為150cm，并用水（22±1℃）填充至直徑15cm的可移動(dòng)平臺(tái)頂部上方1.5cm的高度。用安裝在池上方的攝像機(jī)跟蹤大鼠，該攝像機(jī)連接到運(yùn)行IMAQ PCI-1407軟件的計(jì)算機(jī)。兩次實(shí)驗(yàn)之間的間隔時(shí)間至少為60min。

給以牡荊素14d后，采用定位航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測試。將平臺(tái)放置在目標(biāo)象限中，將大鼠從隨機(jī)象限開始，測定其逃避潛伏期（ELP）：在120s內(nèi)找到平臺(tái)所需時(shí)間，如果大鼠在120s內(nèi)未能找到隱藏的平臺(tái)，則將它們引導(dǎo)至平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10s，本次測試逃避潛伏期記錄為120s。每日3次，每次大鼠入水象限不同，連續(xù)5d，記錄每組大鼠ELP。

完成5d定位航行實(shí)驗(yàn)后24h，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)測試。移走水池中的平臺(tái)，大鼠從平臺(tái)所在象限對(duì)角線位置象限入水，進(jìn)行測試，記錄大鼠在目標(biāo)象限（定向航行實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所在象限）停留的時(shí)間和穿過平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.3 PCR檢測大鼠海馬組織miR-409表達(dá) SD大鼠脊椎脫臼法處死，斷頭后用75%的酒精消毒，剪開腦部的皮膚后分離出顱骨，使雙側(cè)大腦暴露后，分離出雙側(cè)的大腦半球，立即轉(zhuǎn)移至含D-Hank液的培養(yǎng)皿中，小心分離皮層并取出兩側(cè)海馬組織，D-Hank液中漂洗3次后分離血絲和腦膜，得海馬組織，將一側(cè)海馬組織制成海馬神經(jīng)細(xì)胞懸液[7]。miRNA提取試劑盒提取miRNA；使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄；miR-409的定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）用mir-Vana RTqPCR miRNA檢測試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr檢測；采用U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法表示miRNA表達(dá)水平。

1.2.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

將分離出的一側(cè)海馬組織，用4%中性甲醛固定制備石蠟切片，TUNEL細(xì)胞檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。用0.1%磷酸緩沖液（pH 7.4）中的4%多聚甲醛固定。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌后，用0.2%Triton-X 100的甲醇溶液于4℃下透化2min。然后將細(xì)胞與TUNEL試劑在37°C孵育60 min。PBS洗滌，熒光染色。熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色熒光。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)/100計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采取SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采取χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組逃避潛伏期隨著天數(shù)的增加逐漸縮短，模型組大鼠到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間較對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；低劑量牡荊素組大鼠與模型組相比逃避潛伏期未見明顯降低，中、高劑量牡荊素大鼠組逃避潛伏期顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠與對(duì)照組相比，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯下降（P＜0.001）；中、高劑量牡荊素組大鼠與模型組相比，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。模型組大鼠與對(duì)照組相比穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.001）；中、高劑量牡荊素組大鼠與模型組相比穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期

圖2 各組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間

圖3 各組大鼠穿過平臺(tái)次數(shù)

2.2 牡荊素對(duì)大鼠海馬組織miR-409表達(dá)的影響

模型組與正常對(duì)照組相比海馬組織miR-409的表達(dá)顯著性降低（P＜0.001）；牡荊素組與模型組相比，中、高劑量牡荊素組增加海馬組織miR-409的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織miR-409表達(dá)的影響

2.3 牡荊素對(duì)海馬細(xì)胞凋亡的影響

模型組與對(duì)照組相比，可顯著增加海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)（P＜0.001）；與模型組相比，中、高劑量牡荊素組顯著降低凋亡指數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 各組海馬細(xì)胞凋亡情況

3 討論

有研究表明，異氟醚具有潛在的神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)系統(tǒng)的劑量和時(shí)間依賴性損害，在動(dòng)物模型中的研究表明，異氟醚可以誘導(dǎo)整個(gè)大腦，包括海馬和大腦皮層的神經(jīng)元凋亡，引起空間學(xué)習(xí)和記憶障礙[8,9]。本研究中，異氟醚神經(jīng)損傷模型組大鼠在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期延長；空間探索實(shí)驗(yàn)中，其目標(biāo)象限停留時(shí)間和在平臺(tái)出現(xiàn)次數(shù)減少，表明異氟醚損害大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。牡荊素中、高劑量組大鼠在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，逃避潛伏期縮短；空間探索實(shí)驗(yàn)中，其在目標(biāo)象限停留時(shí)間和平臺(tái)出現(xiàn)次數(shù)增加，表明牡荊素可改善異氟醚神經(jīng)損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，它通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后上調(diào)其靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控多種生物學(xué)過程。大多數(shù)miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，并在大腦發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，其可能參與了異氟烷引起的學(xué)習(xí)和記憶障礙[10-12]。miR-409屬于miRNA家族的一員，隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明多種疾病的發(fā)生中存在其異常表達(dá)。miR-409在腫瘤中的表達(dá)高低，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)；急性缺血性腦卒中患者外周血中，miR-409表達(dá)水平明顯降低。miR-409成為近年來研究的熱點(diǎn)。在本研究中，異氟醚神經(jīng)損傷模型組海馬組織miR-409的表達(dá)顯著性降低，牡荊素可以增加miR-409的表達(dá)。同時(shí)，異氟醚神經(jīng)損傷模型組海馬組織凋亡增多，牡荊素可以減低異氟醚神經(jīng)損傷大鼠海馬組織凋亡。這些結(jié)果表明，miR-409過表達(dá)可以減緩異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

綜上所述，異氟醚可損害海馬依賴性大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，而中高劑量的牡荊素可能通過上調(diào)miR-409的表達(dá)，抑制海馬細(xì)胞凋亡，顯著減少異氟醚引起的損傷，提升學(xué)習(xí)記憶能力，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此，牡荊素可能是神經(jīng)毒性藥物治療中有希望的候選藥物，但尚需要進(jìn)一步的研究以確證。

（收稿日期：2020-10-31）