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        艾滋病合并肝細(xì)胞癌患者的病理特征及其對(duì)生存率的影響

        2021-03-03 08:34:34趙輝汪勇許飛龍凌洲焜
        中外醫(yī)學(xué)研究 2021年36期
        關(guān)鍵詞:肝癌差異研究

        趙輝 汪勇 許飛龍 凌洲焜

        近 年 來(lái) 艾 滋 ?。╝cquired immune deficiency syndrome,AIDS)患者生存期明顯延長(zhǎng),預(yù)期壽命已經(jīng)接近普通人群[1]。隨著艾滋病患者的壽命延長(zhǎng),發(fā)生惡性腫瘤的機(jī)會(huì)增加。有研究顯示肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已成為艾滋病患者的發(fā)病率和死亡率的主要原因,人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者的HCC發(fā)病率是普通人的7.7倍[2]。HCC是世界上最難治性的惡性腫瘤之一[3],目前普遍認(rèn)為手術(shù)治療是能夠?qū)崿F(xiàn)根治癌癥及使其獲得長(zhǎng)期生存的最重要手段[4]。但手術(shù)比例低,術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,總體預(yù)后差。近年來(lái),免疫檢查點(diǎn)抑制劑在HCC治療上取得一定突破,有望成為未來(lái)最具前途的治療方式之一。但目前HIV+HCC患者很難獲得公平、合理的治療,許多患者接受不太符合標(biāo)準(zhǔn)的治療甚至根本未接受任何治療[5]。認(rèn)識(shí)不足、缺乏專業(yè)共識(shí)指南及職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)是其重要原因[6]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于手術(shù)治療艾滋病合并肝細(xì)胞癌的臨床、病理研究非常少,也還未見將免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于艾滋病合并肝細(xì)胞癌患者的研究報(bào)道。因此,加強(qiáng)對(duì)該類患者的病理、臨床研究既非常必要又迫在眉睫。筆者近年來(lái)對(duì)HIV+HCC的治療特別是手術(shù)治療進(jìn)行了一系列研究。前期研究發(fā)現(xiàn)對(duì)HIV+HCC患者行根治性肝切除術(shù)是可行的,但更易發(fā)生圍手術(shù)期死亡,肝功能衰竭是圍手術(shù)期死亡的主要原因[7];HIV+HCC患者比非艾滋病HCC患者生存預(yù)后更差,HIV與HCC患者的生存率下降有關(guān)[8]。本研究通過(guò)對(duì)比艾滋病合并肝細(xì)胞癌與非艾滋病肝細(xì)胞癌患者的病理特征,從病理角度探討HIV感染對(duì)HIV+HCC生存率的影響,并尋找PD-1/PD-L1抑制劑治療HIV+HCC的可能依據(jù)。以期能提高對(duì)HIV+HCC患者的認(rèn)識(shí),并為其提供更佳治療決策,改善治療效果。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        回顧性分析2013年1月-2018年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院接受根治性肝切除術(shù)的26例HIV+HCC患者的臨床及病理資料。該26例患者HIV感染診斷經(jīng)廣州市疾病控制中心確認(rèn),均為HIV-1型,均已進(jìn)入艾滋病期。將該26例患者設(shè)定為研究組即艾滋病肝細(xì)胞癌組,簡(jiǎn)稱HIV+組。選擇同一時(shí)期在本院接受根治性肝切除術(shù)的113例未合并艾滋病的肝細(xì)胞癌患者作為對(duì)照,即非艾滋病肝細(xì)胞癌組,簡(jiǎn)稱HIV-組。肝癌診斷及根治性切除標(biāo)準(zhǔn)符合文獻(xiàn)[9]原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版);病理診斷符合文獻(xiàn)[10]原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版);艾滋病診斷符合文獻(xiàn)[11]中國(guó)艾滋病診療指南(2018版)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前影像學(xué)評(píng)估為可切除肝癌;(2)手術(shù)達(dá)到根治性肝癌切除;(3)術(shù)后病理檢查證實(shí)為HCC;(4)術(shù)前肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí)或B級(jí);(5)術(shù)前ECOG評(píng)分0或1分;(6)年齡≥18歲;(7)有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)中發(fā)現(xiàn)有臨近組織侵犯、肝門及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;(2)行腹腔鏡肝切除術(shù);(3)術(shù)前曾合并有肝癌破裂出血;(4)術(shù)前曾行放療、化療和/或消融治療;(5)合并其他惡性腫瘤;(6)合并嚴(yán)重的心、肺、腎等臟器功能障礙。HIV+組26例,全部為男性;年齡28~64歲,中位年齡44.5歲。HIV-組113例,男101例,女12例;年齡29~75歲,中位年齡50歲。該研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.2 方法

        1.2.1 常規(guī)病理檢查 聘請(qǐng)兩位資深病理專家重新閱片,根據(jù)病理資料收集要求單獨(dú)閱片,分別報(bào)告。如出現(xiàn)差異,則討論后一起重新閱片,達(dá)成一致意見。

        1.2.2 PD-L1抗體表達(dá)檢測(cè) 主要儀器:Dako公司Autostainer Link48自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀、全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理儀(PT Link,PT200)。主要試劑:Dako 公 司 EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒:包括 Linker Anti-Mouse、Monoclonal Mouseanti-PD-L1 Clone 22C3、Target Retrieval Solution Low pH (50×)、Peroxidase-Blocking Reageagent、DAB Enhancer、Vi-sualizationI Reagent-HRP、Negative Control Reagent、DAB+Chromogen、Control SlidesDAB+Substrate Buffer等試劑。組織蠟塊切片:取對(duì)照組、檢測(cè)組蠟塊,將蠟塊3 μm切片各兩張,裱在防脫載玻片上。所有蠟塊均分蠟塊陰性對(duì)照組、檢測(cè)組,組織切片65 ℃烤片30 min,二甲苯脫蠟,經(jīng)梯度乙醇至水化后待用。免疫組織化學(xué)染色:免疫組織切片抗原修復(fù)使用Dako全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理儀。先根據(jù)編輯程序打印相關(guān)條形碼,蠟塊測(cè)試及蠟塊陽(yáng)性對(duì)照片各一張,每例病例分組貼好不同條形碼。再將EDTA組織修復(fù)液裝入自動(dòng)免疫組化預(yù)處理儀中,然后扣上儀器蓋。按啟動(dòng)鍵,將修復(fù)液加熱預(yù)溫到65 ℃后。打開儀器蓋,將組織切片及細(xì)胞片浸入修復(fù)液中。繼續(xù)啟動(dòng)預(yù)處理程序進(jìn)行98 ℃,20 min的抗原修復(fù),到程序結(jié)束,將組織切片及細(xì)胞片pH 7.2~7.4 PBS緩沖液洗滌 3 min,蒸餾水洗滌 1 min。

        PD-L1(22C3) 蛋 白 檢 測(cè): 使 用 Da-ko Autostainer Link 48 自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀,Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒上機(jī)檢測(cè)(室溫 22 ℃ ~25 ℃),染色主要步驟:(1)將修復(fù)好的組織切片及細(xì)胞片上機(jī)掃描開始染色,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉 5 min,pH 7.2~7.4 Buffer沖洗,一抗PD-L1(22C3)室溫孵育30 min(陰性對(duì)照片不需要加一抗),pH 7.2~7.4 Buffer沖洗 1 min。二抗室溫孵育 30 min,pH 7.2~7.4 Buffer沖洗 1 min。(2)VisualizationI Reagent-HRP 室溫孵育 30 min,pH 7.2~7.4 Buffer沖洗 1 min;DAB 室溫顯色 5 min×2 ;pH 7.2~7.4 Buffer沖洗 1 min。(3)擴(kuò)大劑室溫 5 min;pH 7.2~7.4 Buffer沖洗 1 min;蘇木精復(fù)染 1 min,無(wú)水乙醇脫水,電吹風(fēng)微風(fēng)吹干,二甲苯透明,中性樹膠封固。

        1.2.3 PD-1抗體表達(dá)的檢測(cè) 儀器、步驟參考PD-L1檢測(cè),抗體試劑采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn)的鼠抗人PD-1單克隆抗體。

        1.2.4 結(jié)果判定 PD-L1免疫組化(TPS)判讀標(biāo)準(zhǔn)(參考試劑盒說(shuō)明書):指部分或完整膜染色的腫瘤細(xì)胞占樣品中存在的所有活腫瘤細(xì)胞的百分比(PD-L1染色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)/總活腫瘤陰性和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)),判讀中應(yīng)排除任何免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、壞死細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)。TPS<1%或無(wú)腫瘤細(xì)胞表達(dá)為陰性,TPS≥1%為陽(yáng)性;TPS 1%~49%為低表達(dá),TPS≥50%為高表達(dá)。PD-1結(jié)果判定參考抗體試劑說(shuō)明書:組織切片中可見目標(biāo)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)有棕色/棕黃色染色,且無(wú)背景染色即染色陽(yáng)性。組織切片中未見目標(biāo)細(xì)胞有棕色/棕黃色染色即為染色陰性。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理,計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)預(yù)后相關(guān)因素采用Kaplan-Meier曲線生存分析、單因素分析,并以對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)(Log-rank)法比較各組間的生存率(OS)。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組臨床基本資料對(duì)比

        HIV+組確診HCC時(shí)的年齡小于HIV-組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、體質(zhì)量指數(shù)、BCLC分期、TNM分期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIV+組術(shù)前肝功能稍差,Child-Pugh評(píng)分B級(jí)占11.5%,而HIV-組為0.9%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021),見表 1。HIV+ 組 CD4+<200 μl 13 例(50.0%),≥200 μl 13 例(50.0%);HIV RNA <400 拷貝 /ml 17 例(65.4%),≥400 拷貝 /ml 9例(34.6%)。

        表1 兩組臨床基本資料對(duì)比

        表1 (續(xù))

        2.2 兩組常規(guī)病理特征對(duì)比

        HIV+組微血管侵犯(MVI)發(fā)生率高于HIV-組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017),HIV+組腫瘤直徑>5 cm比例高于HIV-組(P=0.019),兩組腫瘤分化程度、組織學(xué)分級(jí)及肝硬化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.905、0.101、0.820),兩組肝纖維化分級(jí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.050),見表2。

        表2 兩組常規(guī)病理特征對(duì)比[例(%)]

        表2 (續(xù))

        2.3 不同病理特征肝細(xì)胞癌患者生存率比較

        單因素分析MVI、腫瘤直徑>5 cm影響預(yù)后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

        表3 不同病理特征肝細(xì)胞癌患者生存率比較

        2.4 兩組免疫組化檢查(PD-1/PD-L1表達(dá))對(duì)比

        兩組PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),單因素分析PD-1、PD-L1表達(dá)與預(yù)后不相關(guān)(P>0.05),見表4、表5。

        表4 兩組PD-1/PD-L1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)對(duì)比[例(%)]

        表5 不同免疫組化檢查結(jié)果肝細(xì)胞癌患者生存率比較

        3 討論

        肝細(xì)胞癌通常起病隱匿,早期多無(wú)明顯癥狀,當(dāng)患者就診時(shí)多已進(jìn)展到中晚期,錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期,總體預(yù)后差,多年來(lái)形成的以手術(shù)為主的治療模式正面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來(lái),免疫檢查點(diǎn)抑制劑在抗腫瘤治療領(lǐng)域異軍突起、捷報(bào)頻傳,為肝細(xì)胞癌的治療帶來(lái)了新的希望,但免疫檢查點(diǎn)抑制劑在艾滋病合并肝細(xì)胞癌患者應(yīng)用尚未見相關(guān)研究報(bào)道。原因可能是多方面的,缺乏相關(guān)研究支持就是其中重要原因之一。筆者前期從流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、手術(shù)治療及術(shù)后并發(fā)癥等方面對(duì)該病進(jìn)行了一系列研究。本文從病理角度探討HIV感染對(duì)艾滋病合并肝細(xì)胞癌生存率的影響,并尋找PD-1/PD-L1抑制劑治療艾滋病合并肝細(xì)胞癌的可能依據(jù)。

        本研究中HIV+HCC患者確診時(shí)更年輕,這與文獻(xiàn)[12]相似,主要考慮HIV的免疫協(xié)同作用導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的更快進(jìn)展。另一方面,隨著艾滋病患者生存質(zhì)量不斷改善,其更重視自己身體狀況,更愿意接受規(guī)范隨訪及常規(guī)檢查,也更容易發(fā)現(xiàn)腫瘤。本研究中26例HIV+患者均為男性,男性比例明顯高于HIV-組。性別差異主要考慮HCC好發(fā)于男性,男女比例接近4∶1。也可能與HIV傳播方式的改變有關(guān),近年來(lái)以男男同性傳播為主。BCLC、TNM分期兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明本研究中兩組腫瘤分期及進(jìn)展具有可比性,術(shù)前HIV+HCC患者肝功能稍差,考慮可能與HIV對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷及抗HIV感染治療藥物的毒性作用有關(guān)。

        在本研究中,兩組始發(fā)表現(xiàn)、臨床癥狀相似,但HIV+組容易發(fā)展成更大腫瘤,這可能與機(jī)體感染HIV后腫瘤更具侵襲性,生長(zhǎng)更快有關(guān)。但兩組間肝纖維化分級(jí)尚不能認(rèn)為有差異(P=0.050),是否合并肝硬化兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.820),但無(wú)合并肝硬化比例更高,與文獻(xiàn)[12]相似,提示HIV/HBV患者更易從非肝硬化狀態(tài)進(jìn)展為HCC。目前機(jī)制不完全清楚,考慮是患者免疫功能受損或者HIV的免疫協(xié)同作用及與肝炎病毒共同感染加速了疾病進(jìn)程。本研究中HIV+組更易發(fā)生MVI,兩組間MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017),無(wú)微血管侵犯的患者表現(xiàn)出較好的預(yù)后。近年來(lái)的研究表明:腫瘤大小、腫瘤形態(tài)、腫瘤包膜及癌周強(qiáng)化等與MVI相關(guān)[13]。隨著腫瘤大小的增加,腫瘤向晚期發(fā)展,腫瘤的分化程度及其侵襲性增加,MVI 發(fā)生的概率也隨之上升[14],這與我們的研究有很多相似之處。研究中發(fā)現(xiàn)HIV+組有92.3%為中低分化肝癌,單個(gè)腫瘤直徑大于5 cm者明顯多于HIV-組(P=0.019),這可能就是艾滋病合并肝癌更易發(fā)生MVI的原因。另外,HIV+ HCC患者中位診斷年齡更小,腫瘤更大,說(shuō)明艾滋病患者肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)更迅速,更具侵襲性,更易出現(xiàn)MVI。

        近年來(lái),多項(xiàng)研究證實(shí)免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)肝細(xì)胞癌特別是中晚期肝細(xì)胞癌具有明顯的效果[15-17]。但是,免疫檢查點(diǎn)抑制劑在臨床的全面應(yīng)用還面臨許多問(wèn)題。首先,關(guān)于PD-1和PD-L1在肝細(xì)胞癌上的表達(dá)水平及意義報(bào)道不一,甚至存在一些爭(zhēng)議。李冰等[18]研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在肝癌中表達(dá)顯著增高,并且可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān),但并未報(bào)道表達(dá)率比值。邱曉莉等[19]研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在中分化原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)顯著高于高分化及低分化者。其次,目前PD-L1表達(dá)水平被廣泛認(rèn)可為PD-1/PD-L1抑制劑療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物,但PD-L1檢測(cè)存在缺乏一致性與檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的缺陷[20]。肝細(xì)胞肝癌PD-L1靶向治療的伴隨診斷、判讀閾值等也尚未達(dá)到比較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),目前甚至有文獻(xiàn)在肝細(xì)胞癌采用其他腫瘤的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[21]。但是,不論是先前的各種臨床研究還是新近的藥物試驗(yàn),都沒(méi)有將HIV感染人群納入研究。這為免疫檢查點(diǎn)抑制劑在艾滋病合并肝癌患者中展開治療蒙上了一層陰影。在本研究中,PD-1在HIV+組的表達(dá)為0,在HIV-組的表達(dá)為2.7%,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),也不影響患者的預(yù)后。這與李冰等[18]研究報(bào)道的高表達(dá)存在差異。PD-1在本研究中的低表達(dá)原因目前不清楚。一般認(rèn)為肝細(xì)胞癌組織中PD-1的表達(dá)水平與腫瘤大小、有無(wú)門靜脈癌栓和TNM分期有關(guān),而與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、病理分化程度和臨床分期無(wú)關(guān)[22]。由于PD-1主要在活化淋巴細(xì)胞上表達(dá),由此推測(cè)可能與各種刺激最終導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞功能障礙和衰竭有關(guān),但也有可能與本研究樣本量太小有關(guān)。目前普遍認(rèn)為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療腫瘤時(shí)其治療效果取決于腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)PD-1和PDL1,低表達(dá)或不表達(dá)PD-L1或PD-1的腫瘤,抗體治療效果欠佳[23]。因此PD-1抑制劑是否可以被考慮在艾滋病合并肝癌的免疫治療中有待進(jìn)一步研究證實(shí)。在本研究中,PD-L1在HIV+組與HIV-組的表達(dá)率為(38.5% vs 45.1%),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.537),且不影響患者的預(yù)后,但部分PD-L1表達(dá)人群卻表現(xiàn)出更好的預(yù)后。這是否意味著像非艾滋病肝細(xì)胞癌患者一樣,PD-L1抑制劑也應(yīng)該被考慮到艾滋病合并肝癌的免疫治療中值得進(jìn)一步研究證實(shí)。

        本研究是基于我國(guó)人群的單中心回顧性研究,這可能會(huì)在分析中引入潛在的偏見,且樣本量相對(duì)較小,未能對(duì)HIV+組進(jìn)一步分層分組研究。未來(lái)的研究中,應(yīng)擴(kuò)大樣本并進(jìn)行多中心研究。

        綜上所述,HIV合并肝細(xì)胞癌預(yù)后更差,可能與微血管侵犯有關(guān),腫瘤大小是影響預(yù)后的重要因素,PD-L1抑制劑應(yīng)用于HIV合并肝細(xì)胞癌應(yīng)該被考慮。

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