李玉川， 陸 怡， 馮佳燕， 王建設(shè)

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 a.肝病中心， b.病理科， 上海 201102

糖原累積癥(glycogen storage disease, GSD)是一組由基因突變造成的參與糖原分解和糖原合成過程中酶缺陷導(dǎo)致的先天性糖代謝異常疾病，這些酶缺陷導(dǎo)致糖原在體內(nèi)貯積，主要貯積在肝臟和肌肉。根據(jù)酶缺陷不同，GSD分為15型(0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、、、ⅩⅤ)，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ型主要累及肝臟。GSD Ⅸ型比較常見，約占GSD的25%，該病是由于糖原磷酸化酶激酶(phosphorylase kinase, PHK)缺陷所導(dǎo)致[1]。根據(jù)致病基因的不同，GSD Ⅸ型可分為GSD Ⅸa、GSD Ⅸb、GSD Ⅸc和GSD Ⅸd 4型，其中GSD Ⅸa型最常見，該病是因PHKA2基因突變導(dǎo)致的肝臟PHK α亞單位缺陷，約占GSD Ⅸ型的75%[1]。GSD累及肝臟主要表現(xiàn)為肝腫大，轉(zhuǎn)氨酶水平升高，空腹低血糖，高脂血癥，生長發(fā)育遲緩。臨床上，GSD Ⅸa型易被忽略，本文通過回顧性分析GSD Ⅸa型患者的臨床資料，旨在總結(jié)GSD Ⅸa型的臨床特征，加深對該病的認識。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2018年12月于本院住院，并經(jīng)臨床及基因檢查確診為GSD Ⅸa型的患者。收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、臨床癥狀、體征、血常規(guī)、ALT、AST、肌酸激酶、空腹血糖、空腹血酮、甘油三酯、總膽固醇、乳酸、尿酮體、肝臟病理、基因結(jié)果、治療及隨訪情況。

1.2 基因檢測 收集患者的EDTA抗凝外周血2 ml，用QIAamp@DNA Mini Kit提取試劑盒(美國QIAGEN公司)提取全血基因組DNA。使用二代測序方法檢測已知的20種GSD基因(GYS1、GYS2、G6PC、SLC37A4、GAA、AGL、GBE1、PYGM、PYGL、PFKM、PHKA2、PHKB、PHKG2、PHKA1、PGAM2、LDHA、ALDOA、ENO3、PGM1、GYG1)。測序結(jié)果采用Blast工具與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的基因組序列進行比對，PHKA2使用的參考序列號為NM_000292。搜索千人基因組數(shù)據(jù)庫和HGMD數(shù)據(jù)庫，查看檢測到的突變位點是否已有報道。用PolyPhen-2和Mutation Taster軟件預(yù)測氨基酸替換對基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能的影響。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會審批，批號：復(fù)兒倫審178號。所納入患者均由其監(jiān)護人簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 共納入20例GSD Ⅸa型患者，均為男性，確診年齡1.25～8歲，確診中位年齡為2.5歲。所有患者均有肝腫大，且轉(zhuǎn)氨酶水平升高。19例(95.0%)存在空腹低血糖，1例患者空腹血糖正常。身材矮小5例(25.0%)；高乳酸血癥14例(70.0%)；高甘油三酯血癥9例(45.0%)；高膽固醇血癥5例(25.0%)。8例患者進行了空腹血酮檢查，結(jié)果均升高；5例(25.0%)患者尿酮體陽性；5例(25.0%)患者存在輕度貧血。20例患者均無肌無力、肌張力減低、運動發(fā)育遲緩；血常規(guī)白細胞、中性粒細胞、血小板均無降低，網(wǎng)織紅細胞均無明顯升高；肌酸激酶、尿酸水平均正常。納入GSD Ⅸa型患者的臨床資料詳見表1。

2.2 肝臟病理檢查結(jié)果 20例患者中有18例行超聲引導(dǎo)下肝穿刺術(shù)，肝臟病理結(jié)果符合典型GSD表現(xiàn)，HE染色顯示肝細胞腫脹，肝細胞彌漫性胞漿淡染，胞膜清晰，呈“植物細胞壁”樣排列，胞質(zhì)內(nèi)見大量粉塵樣物，PAS染色出現(xiàn)大量紫紅色顆粒提示肝細胞糖原顆粒蓄積；部分患者MASSON染色顯示不同程度纖維組織增生(圖1)。肝臟病理纖維化程度S0 3例，S1～2 13例，S3 2例。余下2例患者拒絕肝穿刺活檢，無相關(guān)病理結(jié)果(表1)。

表1 20例GSD Ⅸa型患者的臨床及病理資料

注：a，HE染色示肝細胞腫脹，肝細胞彌漫性胞漿淡染，胞膜清晰，呈“植物細胞壁”樣排列(×400)；b，PAS染色示糖原顆粒蓄積(×400)；c，MASSON染色示匯管區(qū)纖維組織輕度增生(×400)。

2.3 基因檢查結(jié)果 20例GSD Ⅸa型患者共發(fā)現(xiàn)16種PHKA2基因突變，均為半合子，包括10種錯義突變、3種剪接突變、1種無義突變、1種缺失突變、1種小片段缺失。16種基因突變中有5種為已知致病突變，11種為新突變。新突變中包括6種錯義突變，使用PolyPhen-2和Mutation Taster預(yù)測軟件顯示為致病突變；1種為無義突變，考慮為致病性突變；3種為剪接突變，考慮為致病性突變；1種為小片段缺失，考慮為致病性突變。有4例患者存在c.3614C>T(p.P1205L)基因突變，1例患者存在c.3614C>G(p.P1205R)基因突變；另有2例患者存在c.883C>T(p.R295C)基因突變。所有患者基因突變情況詳見表2。

表2 20例GSD Ⅸa型患者PHKA2基因檢測結(jié)果

2.4 治療及隨訪情況 20例患者確診后控制甜食的攝入，少量多餐高復(fù)合碳水化合物、足量蛋白質(zhì)飲食，并給予生玉米淀粉口服治療，每次0.6～2.0 g/kg，每6 h 1次。所有患者長期進行門診隨訪。至2020年9月，隨訪1年9個月～5年8個月，門診隨訪身高、體質(zhì)量、肝臟觸診大小、血常規(guī)、肝功能、空腹血糖、肝臟超聲。隨訪期間，17例患者規(guī)律飲食，口服生玉米淀粉，3例(病例2、4、5)規(guī)律飲食，未按要求規(guī)律口服生玉米淀粉。經(jīng)治療，20例患者空腹血糖均正常；17例患者肝功能轉(zhuǎn)氨酶降至正常，3例(病例2、4、5) ALT水平波動在100～200 U/L，AST水平波動在120～200 U/L；19例患者肝臟觸診及腹部超聲顯示肝腫大明顯好轉(zhuǎn)，病例5仍有肝腫大，肝臟肋下10 cm，劍突下8 cm；18例患者身高、體質(zhì)量增長，至2020年9月，身高百分位介于P25～P75，體重百分位介于P25～P97，5例身材矮小患者(身高3rd)身高增長(身高百分位介于P25～P50)，病例4、5身高未見明顯增長(P10)。

3 討論

GSD Ⅸ型是由于PHK缺陷所致，導(dǎo)致不能激活糖原磷酸化酶，引起糖原分解障礙并在體內(nèi)貯積，其發(fā)病率為1/10萬[2]。PHK由α、β、γ和δ 4個亞單位組成，其具有廣泛的組織分布，通過各種PHK相關(guān)基因表達和差異剪接產(chǎn)生多種組織特異性同工酶[3]。GSD Ⅸa型(OMIM*300798)是因PHKA2基因突變導(dǎo)致，PHKA2基因位于Xp22.2-22.1，包含33個外顯子[4]。GSD Ⅸa型為X染色體隱性遺傳病，男性發(fā)病率較高，本研究中20例GSD Ⅸa患者均為男性，符合其X連鎖隱性遺傳的特點。

文獻[5-6]報道，90%以上的GSD Ⅸa型患者存在肝腫大和轉(zhuǎn)氨酶水平升高，38%～48%的患者存在空腹低血糖。由于GSD Ⅸa型糖異生途徑完整，減少了空腹低血糖的發(fā)生，因此，Ⅸa型患者嚴重空腹低血糖少見[7]。本研究中患者空腹血糖波動在2.0～4.5 mmol/L，平均3.1 mmol/L，與文獻報道相符。由于低血糖時脂肪酸氧化代償性增強，因此空腹血酮升高是GSD Ⅸa型的顯著代謝特征[8]。本研究中8例患者進行了空腹血酮檢查，結(jié)果顯示血酮均升高，符合其代謝特征。14例(70.0%)患者乳酸升高，高于文獻[6,9]報道。20例患者尿酸均正常，與文獻[9-13]報道相符。臨床上，GSD Ⅸa型、GSD Ⅰ型均可表現(xiàn)為肝腫大、轉(zhuǎn)氨酶水平升高、高脂血癥、生長發(fā)育遲緩，GSDⅠ型患者除了肝腫大，還表現(xiàn)為腎腫大、腎病，嚴重者可導(dǎo)致終末期腎病，由于血小板功能受損，GSDⅠ型表現(xiàn)為出血傾向，易出現(xiàn)鼻出血和瘀斑，貧血在GSDⅠ型患者中，特別是存在肝腺瘤的患者中比較常見，GSDⅠb 型患者臨床上可出現(xiàn)中性粒細胞減少，易反復(fù)細菌感染[14-15]。本研究所有患者血常規(guī)提示白細胞、中性粒細胞、血小板均無降低，僅5例存在輕度貧血。此外，根據(jù)低血糖的嚴重程度及尿酸水平，也有助于二者之間的鑒別。有文獻[5,7]報道GSD Ⅸa型患者可出現(xiàn)肌張力減低，運動發(fā)育遲緩，但肌酸激酶水平正常。本研究納入患者均無肌無力、肌張力減低、運動發(fā)育遲緩，肌酸激酶水平均正常。綜上GSD Ⅸa型患者的肝外表現(xiàn)有待進一步研究。

本研究中有18例患者行超聲引導(dǎo)下肝穿刺術(shù)。肝臟病理檢查有助于GSD的診斷，但具體分型仍需基因檢查明確。18例患者肝臟病理顯示15例存在不同程度肝纖維化，以輕度纖維化為主，13例(72.2%)患者纖維化程度為1～2級，2例(11.1%)患者纖維化程度為3級。雖然大多數(shù)GSD Ⅸa型臨床表現(xiàn)較輕，預(yù)后較好，但也有進展為肝纖維化、肝硬化的相關(guān)報道[12,16-17]，臨床醫(yī)生應(yīng)提高警惕，注意密切隨訪，必要時行肝穿刺檢查。

目前，HGMD數(shù)據(jù)庫已收錄151例患者，107種基因突變。包括7個剪接突變，9個插入突變，29個缺失突變，11個無義突變及51個錯義突變[5]，PHKA2以錯義突變?yōu)橹?。目前在我國人群中已發(fā)現(xiàn)29種PHKA2基因突變[5-6,9,18-20]。本研究共發(fā)現(xiàn)16種PHKA2基因突變，以錯義突變?yōu)橹?，其?種為已知致病突變，11種為新突變。新突變的發(fā)現(xiàn)進一步豐富了PHKA2基因突變數(shù)據(jù)庫。20例患者中4例存在c.3614C>T(p.P1205L)基因突變，1例患者存在c.3614C>G(p.P1205R)基因突變，提示c.3614位點是本研究的高發(fā)突變位點。中國、日本、韓國、丹麥、荷蘭的人群中均有c.3614C>T的報道[1,11,21-24]，在丹麥人群中發(fā)現(xiàn)該突變存在奠基者效應(yīng)，亞洲或中國人群中是否也存在奠基者效應(yīng)，尚不明確。韓國人群中，大多數(shù)突變類型為缺失突變或剪接突變，50%為大片段缺失，83.3%為剪接突變或缺失突變，韓國人群基因突變特點與其他種族不同[22,25]。本研究是國內(nèi)納入GSD Ⅸa型病例最多的一項研究，也是中國人群中PHKA2新突變最多的一項研究。本研究顯示，我國人群PHKA2基因突變類型以錯義突變?yōu)橹鳎c國內(nèi)其他學(xué)者的研究[6,9]相符。中國人群的PHKA2基因突變特點仍需進一步探究。

生玉米淀粉是治療GSD的主要方法，生玉米淀粉具有分子量大、易在腸道停留的特點，口服后緩慢消化，逐漸釋放葡萄糖，進而使血糖穩(wěn)定在正常水平，減少肝臟的負荷。另外，生玉米淀粉還具有易獲得、無特殊口味、價格便宜的特點，在臨床上使用率較高。與GSDⅠ型相比，GSD Ⅸ型需要生玉米淀粉的量較小[7]。需要引起注意的是使用生玉米淀粉過度或不足均會對患者造成不利影響，過度治療會導(dǎo)致糖原在肝臟貯積，還會引起腹瀉、體質(zhì)量增長過度、胰島素抵抗，治療的目標是使用適量的生玉米淀粉維持血糖在3.9～5.5 mmol/L，血酮在0～0.2 mmol/L[7,26]。本研究中20例患者在兩餐之間使用生玉米淀粉口服，控制血糖穩(wěn)定，控制甜食攝入，減少糖原產(chǎn)生，經(jīng)治療，大多數(shù)患者的生長發(fā)育水平，臨床癥狀及肝功能、血糖好轉(zhuǎn)，3例患者由于未規(guī)律口服玉米淀粉，生長發(fā)育落后，仍有肝腫大、轉(zhuǎn)氨酶水平升高。國外報道[12]即使GSD Ⅸa型不治療，患者也可達到正常的發(fā)育水平，轉(zhuǎn)氨酶水平會隨著代謝的改善和年齡的增長而下降，通常在成年期達到正常水平，肝腫大會在20歲后恢復(fù)正常[7,12,27]。雖然大多數(shù)患者預(yù)后較好，但也可導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化，因此，GSD Ⅸa型患者應(yīng)規(guī)律隨訪。國外推薦，血生化、凝血功能應(yīng)每3～12個月隨訪1次，18歲以下兒童應(yīng)每12～24個月隨訪1次肝臟超聲[7]。

綜上所述，GSD Ⅸa型以男性為主，臨床表現(xiàn)以肝腫大、轉(zhuǎn)氨酶水平升高、生長發(fā)育遲緩、空腹低血糖、空腹血酮升高、尿酸正常為特征。GSD Ⅸa型肝臟病理多數(shù)表現(xiàn)為輕度肝纖維化，少數(shù)患者纖維化程度較重。本文報道了16種PHKA2基因突變，以錯義突變?yōu)橹鳎渲衏.3614位點基因突變是高頻突變位點。發(fā)現(xiàn)了11種PHKA2新突變，是國內(nèi)單中心發(fā)現(xiàn)該基因新突變最多的一項研究，豐富了中國人群PHKA2基因突變圖譜。GSD Ⅸa型大多數(shù)臨床表現(xiàn)輕，早期干預(yù)，預(yù)后較好，長期規(guī)律隨訪，控制血糖穩(wěn)定，改善代謝狀態(tài)至關(guān)重要。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：李玉川負責收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；馮佳燕負責病理報告解讀，提供病理圖片；王建設(shè)參與課題設(shè)計；陸怡參與課題設(shè)計，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。