張雪，宋銀，孫嘉偉，汪海燕，王宿潔，黃瑾，楊磊，*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)部,浙江 杭州 310036)

隨著中國老齡化社會的來臨，各種老年性疾病的發(fā)生也逐步增高，尤其是耳聾。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，在65歲及以上人群，約有三分之一的人患有聽力障礙[1]。在我國，老年人中聽力障礙者約占80%左右[2]。老年性耳聾也稱年齡相關(guān)性聽力損失(ARHL)，指隨年齡增長而出現(xiàn)的雙耳對稱、緩慢、進行性的感音神經(jīng)性聽力減退，具有隱匿性及漸進性發(fā)展的特點，對患者造成嚴(yán)重的身體和心理危害，降低老年人的生活質(zhì)量，加重社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

由于ARHL發(fā)病機制非常復(fù)雜，ARHL的早期診斷極其困難。為了探索其分子機制，一些學(xué)者利用基因芯片技術(shù)，用于指示其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究小鼠模型ARHL發(fā)生過程中的基因表達(dá)變化[3-4]。然而，由于樣本數(shù)量限制，單個微陣列測序往往表現(xiàn)出對高豐度分子鑒定的局限性，結(jié)果往往存在偏差[5]。利用生物信息學(xué)手段可以整合多個微陣列數(shù)據(jù)集，減少這種偏差，從而使結(jié)果更具有客觀性。

本研究中，我們通過挖掘3個與ARHL有關(guān)的GEO數(shù)據(jù)集，獲得了異常表達(dá)的基因，綜合分析，獲得與ARHL高度相關(guān)的核心基因，并通過預(yù)測其下游的信號通路及可能調(diào)控這些核心基因的miRNA，進一步明確核心基因與ARHL的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 年齡相關(guān)性聽力損失相關(guān)基因芯片的篩選

使用GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫以hearing loss and aging為關(guān)鍵詞搜索基因芯片，按以下標(biāo)準(zhǔn)納入結(jié)果：(1)研究與年齡相關(guān)性聽力損失有關(guān)。(2)小鼠模型為會發(fā)生年齡相關(guān)性聽力損失的模型。(3)芯片檢測內(nèi)容為差異基因。

1.2 差異基因分析

對于從GEO篩選到的數(shù)據(jù)集，使用R語言RMA包[6]對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，隨后使用R語言的limma包[7]分析差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和| logFC |>0.5。

1.3 核心基因篩選

將差異基因上傳至STRING(用于搜索相互作用基因的搜索工具；https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫分析基因相互作用并下載蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，然后將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscap[8]軟件，利用CytohHubba[9]插件富集出連接數(shù)位于前10的核心基因。

1.4 KEGG通路富集分析

將篩選的10個核心基因，使用R語言的clusterProfiler包括KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，得到可能發(fā)揮作用的通路(P<0.05)。

1.5 預(yù)測調(diào)控核心基因的miRNA

使用miRDB數(shù)據(jù)庫 (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php)預(yù)測靶向10個核心基因的miRNA，然后使用 Cytoscap構(gòu)建它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，利用CytohHubba[9]插件篩選出節(jié)點數(shù)靠前的miRNA。

2 結(jié)果

2.1 ARHL相關(guān)基因芯片篩選結(jié)果

我們在GEO數(shù)據(jù)庫中，篩選出了3個與ARHL有關(guān)的mRNA芯片，分別為GSE6045，GSE62173和GSE35234。GSE6045使用了DBA/2 J(DBA)小鼠作為ARHL的模型動物，檢測了7周齡和36周齡小鼠耳蝸的基因表達(dá)。GSE62173同樣使用了DBA/2 J(DBA)小鼠，檢測了4周齡和12周齡小鼠耳蝸的基因表達(dá)。GSE35234使用了C57/BL6j小鼠作為ARHL的模型動物，檢測了4周齡、15周齡和45周齡小鼠耳蝸的基因表達(dá)。我們使用主成分分析(PCA)評估芯片每組樣本的獨立性(圖1)。結(jié)果顯示數(shù)據(jù)集GSE6045，GSE62173和GSE35234中的對照組和實驗組樣本之間分離程度很好。

A—基因芯片GSE45026的主成分分析圖 B—基因芯片GSE62173的主成分分析圖 C—GSE35234基因芯片的主成分分析圖PC1，PC2代表芯片的兩種主要組分，紅點代表老年組，藍(lán)點代表年輕組。圖1 ARHL基因芯片的主成分分析圖

2.2 ARHL相關(guān)差異基因分析

我們分析基因芯片的差異基因后使用火山圖對其進行可視化，火山圖(圖2A，C，E)顯示了3個數(shù)據(jù)集中差異基因的分布。我們在GSE6045中共篩選到1 871個差異基因，包括740個上調(diào)基因和1 131個下調(diào)基因，在GSE62173 中篩選到313個差異基因，包括153個上調(diào)基因和160個下調(diào)基因，在GSE35234中篩選到958個差異基因，包括498個上調(diào)基因和460個下調(diào)基因。將3個芯片的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別取交集，結(jié)果顯示3個基因芯片中有105個共同上調(diào)基因(圖2G)和121個共同下調(diào)基因(圖2H)。

圖2 ARHL差異基因的篩選

2.3 ARHL核心基因的篩選

對于篩選到的105個共上調(diào)基因和121個共下調(diào)基因，我們利用STRING數(shù)據(jù)庫，分析出基因間的相互作用關(guān)系(圖3A，C)。根據(jù)基因的相互作用關(guān)系，我們從105個共上調(diào)基因中富集出10個上調(diào)的核心基因即MPo，Hp，Cd52，Elane，II1b，H2-K1，Tyrobp，Cd74，Lcp1和Ptprc(圖3B)；我們從121個共下調(diào)基因中富集處10個下調(diào)核心基因即MPo，Hp，Cd52，Elane，II1b，H2-K1，Tyrobp，Cd74，Lcp1和Ptprc(圖3D)。

圖3 ARHL基因芯片的核心基因篩選

A：10個下調(diào)核心基因的KEGG富集分析結(jié)果圖4 ARHL下調(diào)的10個核心基因的KEGG富集分析

2.4 ARHL核心基因的KEGG富集分析

年齡相關(guān)性聽力損失是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，對于退行性疾病我們一般關(guān)注下調(diào)基因。對于富集到的10個下調(diào)核心基因，KEGG富集分析結(jié)果顯示：Col3a1，Col1a2，Col4a2，Col2a1和Col5a2主要富集在Protein digestion and absorption，ECM-receptor interactions，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Amoebiasis，Relaxin signaling pathway，F(xiàn)ocal adhesion等信號通路(圖4A)。

2.5 調(diào)控ARHL核心基因的miRNA分析

我們使用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRDB預(yù)測了調(diào)控10個下調(diào)核心基因的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中有8個核心基因(Col3a1，Col1a2，Sparc，Col4a2，Col2a1，Lox，Col5a2，Postn)可以被miRNA靶向調(diào)控(圖5A)。miRNA與基因存在著多對多的調(diào)控關(guān)系，我們使用Cytoscap軟件對預(yù)測到的miRNA進行了篩選，從中篩選到了連接數(shù)最多的2個miRNA即 miR-29c-3p，miR-29a-3p(圖5B)。miR-29c-3p和miR-29a-3p與6個核心基因(Col3a1，Col4a2，Col2a1，Lox，Sparc，Col5a2)均存在著調(diào)控關(guān)系，可以認(rèn)為其為老年性聽力損失中的重要miRNA。

A：調(diào)控8個下調(diào)基因的miRNA預(yù)測結(jié)果;B：調(diào)控8個下調(diào)基因的miRNA中重要miRNA的篩選結(jié)果。圖5 靶向下調(diào)ARHL核心基因的miRNA預(yù)測及核心miRNA的篩選

3 討論

ARHL造成了約30%的老年人生活質(zhì)量下降，在全球范圍內(nèi)正在成為一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，但目前對其早期診斷非常困難。基因芯片技術(shù)可以檢測人類中數(shù)以千萬個基因的表達(dá)水平，已被廣泛用于研究各種疾病的分子變化、預(yù)測潛在的治療靶標(biāo)以及尋找早期診斷生物標(biāo)志物。本研究從3個與ARHL有關(guān)的基因芯片，篩選了10個與其有關(guān)的核心基因，為ARHL的早期診斷提供可能的分子靶標(biāo)。

ARHL是一種退行性疾病，各種重要基因隨年齡變化開始表達(dá)下調(diào)。小鼠是研究哺乳動物聽覺功能和衰老的主要生物模型動物[10]。據(jù)報道某些品系小鼠隨年齡增長其聽力變化不大(例如CAST，CBA/CaJ，CBA/J，C3H/HeH)，而某些品系表現(xiàn)出隨年齡變化聽覺功能逐漸下降的特點(例如BALB，C57BL/6，DBA/2 J)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析了C57BL/6、DBA/2 J小鼠中多個數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)譜，通過集成多個數(shù)據(jù)集來提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度[11]。GSE6045、GSE35234和GSE62173中使用的C57BL/6，DBA/2 J小鼠都具有隨年齡增長而發(fā)生聽力損失的特性。使用R語言分析后，我們在三個芯片中篩選到了226個共表達(dá)基因，其中包括105個上調(diào)基因和121個下調(diào)基因(|log2FC|>0.5,P<0.05)。

為了篩選ARHL中的核心基因，我們將獲得的下調(diào)基因映射到STRING數(shù)據(jù)庫并獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。眾所周知，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度較高的基因通常起重要作用。我們在下調(diào)基因中選擇了節(jié)點排名前10的基因確定為核心基因，分別是：Col3a1，Col5a2，Sparc，Col4a2，Col2a1，Col1a1，Lox，Ctgf，Postn和Acan。其中Col家族是一類與膠原蛋白形成有關(guān)的基因，我們預(yù)測發(fā)現(xiàn)在ARHL動物模型中Col家族基因表達(dá)下調(diào)。膠原蛋白是內(nèi)耳細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其中，II型膠原蛋白在整個耳蝸和螺旋韌帶中含量最高[12]，對于螺旋狀韌帶中離子傳輸系統(tǒng)的完整性至關(guān)重要。在F344大鼠中，II型膠原蛋白在螺旋韌帶和血管紋連接區(qū)域的明顯減少造成了老年F344大鼠的聽力損失[13]。此外，內(nèi)耳的蓋膜也主要是膠原蛋白組成[14-15]。以上研究表明在ARHL中，膠原蛋白隨年齡減少，與耳聾的發(fā)生有關(guān)，這與我們的分析不謀而合。我們還發(fā)現(xiàn)，Sparc基因在ARHL中表達(dá)下調(diào)，Sparc是一種能夠編碼多功能細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)糖蛋白的基因，當(dāng)耳蝸功能成熟并需要鈣水平快速變化時，SPARC可能在直流的鈣調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[16]，可能與聽力損失有關(guān)，與我們的預(yù)測結(jié)果不謀而同。Ctgf基因在ARHL也表達(dá)下調(diào)，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在嚴(yán)重的脊髓損傷后，CTGF重組蛋白能有效地再生功能神經(jīng)系統(tǒng)組織[17]。提示Ctgf基因在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷恢復(fù)中可能發(fā)揮重要作用，而耳聾也屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

為了驗證核心基因與ARHL發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，我們分析了其下游的信號通路。在本研究中，Col家族在ECM-receptor interactions，PI3K-Akt signaling pathway，F(xiàn)ocal adhesion信號通路中顯著富集。有文獻(xiàn)報道，F(xiàn)ocal adhesion參與了血管生成期間調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和增殖，PI3K/Akt信號在血管發(fā)生，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞延長和內(nèi)皮毛細(xì)管穩(wěn)定性方面起重要作用[18]。也有研究[19]發(fā)現(xiàn)miR-29通過PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)人Tenon成纖維細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)。因此，Col家族基因下調(diào)可能通過ECM-receptor interactions，PI3K-Akt signaling pathway，F(xiàn)ocal adhesion信號通路介導(dǎo)耳蝸血管內(nèi)皮細(xì)胞的退化，從而抑制耳蝸的血管生成，造成血管紋的異常，最終影響聽功能。但是，目前的研究結(jié)果需要更深入地實驗研究來證實。

miRNA是一類短的非編碼RNA，其大小約20～25個核苷酸，可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，是細(xì)胞衰老的重要調(diào)節(jié)劑,在神經(jīng)退行性疾病中會表達(dá)失調(diào)[20]。在本研究中，我們對核心基因的上游miRNA進行了預(yù)測，通過miRDB網(wǎng)站預(yù)測了3000個可能調(diào)控核心基因的miRNA，發(fā)現(xiàn)多個miRNA和多個基因存在著調(diào)節(jié)作用，通過cytoscap軟件篩選得到了2個重要的miRNA即miR-29a-3p，miR-29c-3p。已有文獻(xiàn)表明miR-29在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用，如心血管[21]、視網(wǎng)膜功能[21]、以及阿爾茨海默病[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ARHL模型中，miR-29家族和miR-34家族的表達(dá)上調(diào)[23]，眾所周知，它們是促凋亡途徑的調(diào)節(jié)劑。越來越多研究表明，miR-29通過負(fù)向調(diào)控編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的mRNA，在基質(zhì)沉積，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化進程中起著重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)是調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵成分[24]，主要參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，分化和遷移。綜上所述，miR-29家族的變化與ARHL的相關(guān)性非常密切。

總而言之，我們的研究分析了GEO數(shù)據(jù)庫中與ARHL有關(guān)的3個mRNA基因芯片，發(fā)現(xiàn)了與ARHL相關(guān)的的核心基因，并通過分析核心基因作用的信號通路和調(diào)控核心基因的miRNA進行了驗證，進一步說明了核心基因與ARHL的相關(guān)性，這些基因可能作為ARHL的診斷性生物標(biāo)志物，應(yīng)引起更多的關(guān)注?；谏镄畔W(xué)分析的結(jié)果，尚需要進行進一步的實驗驗證，后續(xù)的研究需要利用細(xì)胞實驗和動物實驗進行深入的驗證，進而為尋找靶向ARHL新的診斷標(biāo)志物提供重要的科學(xué)依據(jù)。