孫欽榮，張波，陳韓英

(石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

發(fā)熱[1]使神經(jīng)系統(tǒng)興奮性升高，甚至有些高熱病人神經(jīng)系統(tǒng)由于過度興奮處于抑制狀態(tài)，表現(xiàn)出神情淡漠、嗜睡等，如中暑后的熱休克[2]。引起發(fā)熱的疾病很多且較為復雜，是臨床對疑難疾病診治中的難點，其中絕大多為由感染引起的急性短期發(fā)熱，常見于腫瘤，血管-結(jié)締組織病，及細菌，燒燙傷等[3]引起的全身性感染或者使用一些化學致熱劑如減肥藥2，4-二硝基苯酚引起的體溫過高等[4]。發(fā)熱是人體的一種防御性反應，但體溫過高或時間過長可使機體各種調(diào)節(jié)功能失調(diào)，甚至危及生命。目前臨床治療發(fā)熱主要針對病因，根據(jù)感染源不同選擇藥物進行治療，脫水的患者要積極進行補液及降溫處理[5]，嚴重者給予鎮(zhèn)靜、解痙、退熱和吸氧等措施[6]，一般常用降溫和鎮(zhèn)靜的藥物有如阿司匹林，糖皮質(zhì)激素，地西泮等，這些雖能快速降低體溫緩解焦慮，見效快，但療效單一，長期使用有一定副作用，而中醫(yī)理論中“清熱解毒”、“辛涼解表”等治療觀點與現(xiàn)代解熱作用相似，中藥無成癮性及副作用少的優(yōu)點使其大力發(fā)展得到廣泛而深入的研究，因此尋找更多具有解熱鎮(zhèn)靜作用的中藥或活性分子可作為研究的重點。

依據(jù)中醫(yī)“治熱以寒”的經(jīng)驗紫草的使用頻次很高，新疆軟紫草為主要藥用來源，極具地方特色，研究和發(fā)展也最為成熟[7]。相對于其他中草藥，雖然它的藥理作用趨于成熟且顯示出優(yōu)異的藥效，但對于中樞的作用尚不清晰，因此本文以SK作為新疆軟紫草的代表分子，基于SK治療血熱證(Blood heat syndrome，BHS)[8]及對中樞保護的研究，從系統(tǒng)藥理學角度探討并驗證SK對中樞可能的解熱鎮(zhèn)靜作用，為新疆軟紫草對于中樞的作用奠定現(xiàn)代藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組與給藥

實驗動物為昆明小鼠(SPF級，許可證號SYXK(新)2018-0003)，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物研究中心。鼠齡(6～8周)，體重(18～26 g)，所有實驗均按照實驗規(guī)定進行，操作和管理均遵守《實驗動物管理條例》和《石河子大學動物管理條例》。

36只雄性昆明小鼠隨機分為6組，分別為生理鹽水對照組，2，4-二硝基苯酚模型組，陽性對照組，SK給藥組(5 mg·kg-1，10 mg·kg-1，20 mg·kg-1)。其中陽性對照有2個：阿司匹林200 mg·kg-1造模前2 h單次灌胃給藥作為解熱作用對照，阿普唑侖2 mg·kg-1造模前4 h單次腹腔注射給藥作為鎮(zhèn)靜作用對照；此外SK組造模前4 h單次腹腔注射不同劑量的SK。

1.1.2 試劑與藥品

紫草素(Shikonin，純度≥98%，南京道斯夫生物科技有限公司)，生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，2，4-二硝基苯酚(DNP，北京試劑)，阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，阿普唑侖(北京益民藥業(yè)有限公司)，戊巴比妥鈉(新華化工廠)

1.1.3 儀器

電子天平AR-2140型(梅特勒-托利多儀器有限公司)，曠場/MORRIES水迷宮動物行為視頻分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學院科學院藥物研究所)，小鼠電子肛溫計(北京東西儀科技有限公司)，AU680自動生化分析儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 軟紫草網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

1.2.1.1 軟紫草化學成分和靶點的網(wǎng)絡(luò)建立及分析

基于大量文獻和數(shù)據(jù)庫如TCMSP[9]，中國天然產(chǎn)物化學成分數(shù)據(jù)庫，中藥化學數(shù)據(jù)庫-TCMID[10]等收集紫草的化學成分，利用admet SAR方法[11](http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/)預測所有化學分子吸收和代謝相關(guān)參數(shù)，篩選口服生物利用度較高的成藥分子，利用基于網(wǎng)絡(luò)推理法平衡的子結(jié)構(gòu)藥物靶點方法(balanced substructure-drug-target network-based inference model，bSDTNBI)預測靶點，將所有化學成分和靶點導入到Cytoscape 3.6.1(http://www.cytoscape.org/)中構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，關(guān)鍵靶點導入基因功能分析網(wǎng)站進行KEGG通路富集來獲得參與的相關(guān)生物學過程及通路。

1.2.2 分子對接

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，本文通過對關(guān)鍵靶點和藥物分子之間的相互作用預測其結(jié)合模式和親和力來驗證紫草活性成分與相關(guān)靶標之間的作用。使用AutoDock Vina程序?qū)⑿碌玫降氖荏w與配體結(jié)構(gòu)進行反復對接以達到穩(wěn)定構(gòu)象。此外使用計算機集群分別對蛋白環(huán)境和小分子環(huán)境之間相互作用能進行系綜平均，從而計算出受體-配體結(jié)合自由能。

1.2.3 BHS小鼠模型的建立

血熱證指臟腑火熱熾盛，熱迫血分，以出血、瘡癤與實熱癥狀為主要表現(xiàn)的證候。《中醫(yī)診斷學》[13]將“血熱”描述為 “發(fā)熱，口渴，面赤或顴紅，煩躁不寧，小便黃短，大便燥結(jié)等表現(xiàn)，因此本文單次頸部皮下注射25 mg·kg-1的DNP建立BHS小鼠模型，并檢測小鼠的體溫，飲水量，尿液量，糞便含水量等作為成功建立BHS小鼠模型的標準[8,14]。

1.2.4 對BHS小鼠凝血系統(tǒng)的影響

DNP注射120 min后，各組小鼠以10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，2 mL全血使用肝素抗凝，測定內(nèi)外源性凝血功能指標。

1.2.5 對BHS小鼠自主活動次數(shù)的影響

各組小鼠分別提前放入活動箱適應5 min，給藥后記錄小鼠的自主活動次數(shù)(移動次數(shù)，梳理次數(shù)，抬上肢次數(shù))。

1.2.6 BHS小鼠體溫測定

實驗前每早晚各測一次小鼠直腸溫度(TR)，同一時間段肛溫變化低于±0.5 ℃的小鼠被挑出用于后續(xù)實驗。建立小鼠模型2 h或4 h前給藥并測量0至480 min內(nèi)小鼠的TR。

1.2.7評估在正常和BHS小鼠體內(nèi)對戊巴比妥鈉誘導睡眠作用的影響

給藥后各組小鼠分別腹腔注射戊巴比妥鈉(70 mg·kg-1)，觀察并記錄入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間，評價藥物對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠作用的影響。

1.2.8曠場實驗分析對BHS小鼠的自主行為的影響

借助MORRIES水迷宮動物行為視頻分析系統(tǒng)記錄運動總距離，平均速度及運動軌跡為其鎮(zhèn)靜作用增加證據(jù)，為避免不同小鼠之間氣味的影響，每只小鼠在此空間檢測完后用75%酒精擦拭以消除影響。

1.2.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 軟紫草網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

2.1.1軟紫草活性化學成分與靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

匯總TCMSP等多個數(shù)據(jù)庫和文獻的檢索結(jié)果共收集105個化學成分，經(jīng)過口服生物利用度(OB≥30%),類藥性(DL>0.18)，Caco-2細胞滲透率以及CYP450代謝酶(包括1A2，2C9，2D6，2C19，3A4)篩選打分[15]，排在首位的是SK和阿卡寧(表1)，兩者為旋光性不同的光學異構(gòu)體，SK含量比阿卡寧高，因此本文將選擇SK作為活性分子驗證軟紫草的藥效。

表1 ADME性質(zhì)預測TOP20的紫草化學成分

基于bSDTNBI方法預測及文獻報道，共計218個靶點。對排名前20的紫草活性成分和作用靶點關(guān)聯(lián)，如圖1a所示，MCODE網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析(圖1b)顯示主要與免疫炎癥，中樞神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，氧化應激，血液循環(huán)和物質(zhì)代謝有關(guān)，其中與中樞神經(jīng)模塊打分最高。

由圖1b中紅色和橙色節(jié)點所見，該網(wǎng)絡(luò)中OPRM1，OPRK1，HTR2A，ACHE，ADRB2，GABRG2等72個靶點度值和節(jié)點關(guān)聯(lián)度較高，為紫草與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)靶點，關(guān)鍵靶點的KEGG通路分析(圖1c)顯示主要在神經(jīng)-受體配體關(guān)系通路中發(fā)揮作用，而KCNH2，CDK2，MAPK10，BCL2L1等靶點主要分布在癌癥通路，與紫草抗腫瘤作用有關(guān)，其他相關(guān)性較大的有藥物代謝和氮代謝通路。其中與中樞神經(jīng)相關(guān)的OPRM1，OPRD1，OPRK1及GABRG2等靶點的貢獻程度很大，并且研究顯示γ-氨基丁酸/谷氨酸受體，阿片受體與鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛直接有關(guān)，可參與多種行為和生理控制的過程[16]，提示了紫草的鎮(zhèn)靜作用可能與阿片樣物質(zhì)系統(tǒng)和抑制或興奮性遞質(zhì)的代謝有關(guān)，因此本文后續(xù)將結(jié)合藥靶互作的方法對此進行驗證。

圖1 新疆軟紫草化學成分靶點及MCODE和關(guān)鍵KEGG通路分析

2.1.2 藥靶互作

本文選擇結(jié)構(gòu)具有高解析度 X 射線蛋白晶體結(jié)構(gòu)為模板，參照方法2.1.2進行對接。如圖2a和圖2b所示，SK與阿片受體(OPRK1和OPRD1)的結(jié)合能為-8.80 kcal·mol-1和-8.00 kcal·mol-1，有較強的親和力，與特異性阿片受體拮抗劑納洛酮的親和力相似(圖2c、2d，分別為-9.50 kcal·mol-1和-8.40 kcal·mol-1)。其次將戊巴比妥鈉作為陽性參照，發(fā)現(xiàn)SK和γ-氨基丁酸受體(GABA)及谷氨酸受體(Glu)結(jié)合作用強于戊巴比妥鈉，其中GABA受體結(jié)合能力強于Glu受體(圖2e～2h)。此外，驗證了SK與中樞最終致熱介質(zhì)PGE2兩個關(guān)鍵合成酶COX-2和PTGES的作用關(guān)系，其結(jié)合能力分別為-9.00 kcal·mol-1和-7.70 kcal·mol-1，強于阿司匹林-6.70 kcal·mol-1和-5.80 kcal·mol-1(圖2i～2l)。

圖2 分子對接打分

2.1.3SK對BHS小鼠的生存保護及解熱作用

如圖3a，單次頸部皮下注射DNP 30 min后觀察到小鼠TR在60 min達到(39.36±0.09)℃，熱程持續(xù)90 min。造模前2 h阿司匹林灌胃，SK給藥組(5 mg·kg-1，10 mg·kg-1，20 mg·kg-1)造模前4 h單次腹腔注射小鼠后發(fā)現(xiàn)SK各組小鼠體溫最高分別達到(38.75±0.41)℃，(38.30±0.10)℃，(37.96±0.47)℃，表明SK能降低BHS小鼠體溫，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

同時為觀察SK對DNP誘導高熱小鼠的生存率，小鼠注射DNP 2.50 mg·mL-1，結(jié)果顯示空白組小鼠無死亡，BHS小鼠生存時間最長達到60 min，而SK各組和阿司匹林顯著提高了BHS小鼠的存活率(P<0.05)(圖3)。

Ctrl：正常對照組，Asp：阿司匹林組；圖3 SK對BHS小鼠的保護及解熱作用

2.1.4 SK對BHS小鼠一般診斷標準的作用

造模過程中，BHS組小鼠全程煩躁不安，小鼠口唇色鮮紅，頸部被毛明顯出現(xiàn)“發(fā)汗”現(xiàn)象，飲水量增加，尿液量，糞便含水量均減少(P<0.05或P<0.01)。根據(jù)解熱效果選擇SK 10 mg·kg-1初步評估對BHS小鼠的藥效，表2顯示SK組小鼠活動量較BHS模型組減少，口唇色淡，“發(fā)汗”現(xiàn)象出現(xiàn)減少，飲水量量顯著減少，尿量增加，糞便含水量顯著增加(P<0.05或P<0.01)，說明SK對BHS小鼠的血熱證有改善作用。

表2 血熱證診斷標準打分標準記錄表

2.1.5 SK對BHS小鼠凝血指標的影響

相對于空白對照組，BHS組APTT時間顯著延長，F(xiàn)IB含量顯著升高(P<0.01)，PT顯著延長，TT時間顯著縮短(P<0.05)，總凝血時間顯著延長(P<0.01)；與BHS組比較，SK顯著縮短APTT和PT(P<0.05)，降低FIB含量(P<0.01)，SK組TT有延長趨勢，無顯著性，但其凝血時間顯著縮短(P<0.01)；阿司匹林與SK作用都對TT時間沒有顯著影響(表3)。

表3 SK對BHS小鼠凝血功能的影響

2.1.6SK降低BHS小鼠體溫，減少自主活動次數(shù)

由于DNP引起小鼠核心體溫快速上升，使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感神經(jīng)高度興奮產(chǎn)生一系列行為表現(xiàn)，本實驗以SK對BHS小鼠的核心體溫和自主活動次數(shù)的影響評估其解熱帶來的鎮(zhèn)靜作用。根據(jù)實驗3.3的結(jié)果，考慮到LD50效應，因此后續(xù)實驗將降低SK給藥濃度，調(diào)整為4 mg·kg-1，8 mg·kg-1，16 mg·kg-1。如圖4 b結(jié)果顯示與BHS小鼠自主活動次數(shù)相比，SK組(4 mg·kg-1，8 mg·kg-1，16 mg·kg-1)顯著減少小鼠的自主活動次數(shù)(P<0.01)，而阿普唑侖組雖顯著減少了BHS小鼠的活動次數(shù)，但對其體溫并沒有降低的效果。

DNP：BHS模型組，Alprazolam：阿普唑侖組；#P<0.05，##P<0.01，SK組vs BHS組，圖4 SK對BHS小鼠體溫和自主活動次數(shù)的影響

2.2 SK對戊巴比妥鈉誘導的睡眠時間有協(xié)同作用

如圖5b所示，與空白組對比，SK能明顯延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間，但并沒有縮短睡眠潛伏期(圖5a)，且SK(16 mg·kg-1)在對延長戊巴比妥鈉小鼠睡眠時間的作用上強于阿普唑侖(P<0.01)。對于BHS小鼠，與空白組對比，SK(4、8、16 mg·kg-1)顯著延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間(P<0.01)。

此外，圖5c及圖5d顯示了SK對正常小鼠的鎮(zhèn)靜效果強于BHS小鼠，其中第一列為正常小鼠，第二列為BHS模型小鼠。

#P<0.05，##P<0.01，SK組vs BHS組圖5 SK對戊巴比妥鈉誘導的睡眠作用的影響

2.3 曠場實驗顯示SK減少BHS模型小鼠的運動總距離及運動速度

為增加SK鎮(zhèn)靜作用的客觀證據(jù)，分析記錄了SK對BHS小鼠曠場實驗中的自主活動情況。圖6a及圖6b顯示相同時間內(nèi)SK(4、8、16 mg·kg-1)明顯減少了BHS小鼠的運動總距離，SK(8、16 mg·kg-1)有效減少了BHS小鼠的運動平均速度，運動軌跡顯示其藥效弱于阿普唑侖(圖6c)。

a：運動總距離b：運動平均速度 c：運動軌跡，#P<0.05，##P<0.01，SK組vs BHS 組圖6 SK對BHS小鼠的運動總距離及運動速度的影響

3 討論

中醫(yī)以“熱者寒之”的原則使用清熱藥治療熱證，根據(jù)清熱方劑用藥規(guī)律及新疆軟紫草清熱涼血的用藥基礎(chǔ)[7]，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學集合TCMSP等多個數(shù)據(jù)庫[9-10]和文獻挖掘獲得105個新疆軟紫草化學成分，通過ADME性質(zhì)[11]綜合Caco-2以及CYP450代謝酶打分篩選出排名前20的化合物，其中萘醌類SK(R型)與阿卡寧(S型)為主要成藥分子，目前研究發(fā)現(xiàn)SK類化合物比阿卡寧含量高，是紫草的主要藥效成分。紫草入心、肝經(jīng)，肝藏血，故清熱涼血，心主神，可清熱醒神，現(xiàn)代研究表明SK為脂溶性分子，半衰期為8.79 h，分布容積為8.91 L·kg-1，能透過血腦屏障對腦損傷[17]和中樞神經(jīng)有保護作用[18-19]。

研究表明SK可治療多種血液系統(tǒng)疾病如白血病、敗血癥等[20]，并具有促進血管內(nèi)凝血、減少出血量的作用[8]，能抑制神經(jīng)元凋亡和其他物質(zhì)對神經(jīng)元的毒性[21]，減少外周或脂多糖刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞PGE2的產(chǎn)生[22]。從紫草活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及KEGG富集分析來看，TNF，IL-6，NOS，PTGER3，PTGFR等靶點與合成前列腺素PGE2有關(guān)，多數(shù)靶點如OPRM1，OPRK1，ADRA2A，DRD1，GBRAG2等均富集在神經(jīng)配體-受體關(guān)系通路，EGFR，MAOA，NOS2和NQO1分布在血液循環(huán)系統(tǒng)，分別對應紫草抗炎，神經(jīng)保護及止血等作用，說明紫草涼血安神作用的可能機制，其他為癌癥、藥物代謝，免疫性疾病等相關(guān)通路，也從另一方面表明紫草可能對多種疾病引起的發(fā)熱過程均有治療作用，啟示了紫草可作用于多靶點、多環(huán)節(jié)生物學過程的清熱作用。

“血熱證”以血液妄行，發(fā)熱，甚者神昏為主要臨床表現(xiàn)，神昏為發(fā)熱引起的中樞神經(jīng)興奮。本文在Yuka Sato等人研究DNP誘導核心溫度升高影響腎臟損傷以及本課題組成功建立血熱證模型小鼠的基礎(chǔ)上[8,23]，發(fā)現(xiàn)DNP可在短時間發(fā)熱，現(xiàn)象明顯，操作簡單方便，符合中醫(yī)血熱證中“熱邪入血，血熱妄行，發(fā)熱神昏”的特點及現(xiàn)代臨床中熱休克等臨床表現(xiàn)，因此本文基于BHS小鼠模型探究了SK的中樞解熱鎮(zhèn)靜作用。實驗結(jié)果指出SK改善了血熱證的“發(fā)汗”，飲水量增加，尿液量，糞便含水量減少等現(xiàn)象及凝血系統(tǒng)等指標，顯著縮短了凝血時間，降低了BHS小鼠的體溫及活動量，并對戊巴比妥鈉誘導的睡眠作用有協(xié)同作用，同時曠場顯示SK對BHS小鼠焦慮行為有抑制作用，表明SK有效抑制了“熱邪入血，迫血妄行攪亂神明，即血熱引起腦血流量增加，使交感神經(jīng)興奮”的過程，因此紫草“清熱涼血”不僅體現(xiàn)在對血液系統(tǒng)選擇[24]，還體現(xiàn)在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。

綜上所述，本文從中醫(yī)“熱擾心神”的角度出發(fā)，基于紫草“清熱涼血”功效使用血熱證小鼠模型評價了SK對于由具體熱帶來的抽象熱的抑制作用，實驗結(jié)果表明SK有效解熱劑量遠小于阿司匹林，較高劑量的SK鎮(zhèn)靜作用強度強于阿普唑侖。通過MCODE分析和藥靶互作首次發(fā)現(xiàn)SK的中樞抑制作用與GABA突觸后抑制及阿片受體激活有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)SK對發(fā)熱以及中樞興奮的抑制作用可能與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞與代謝相關(guān)，PTGES也可作為解熱藥物研究的新靶點，體現(xiàn)了新疆軟紫草活性分子SK相對于西藥療效單一多靶點作用機制的優(yōu)勢。但針對本文中與中樞抑制相關(guān)的靶點和具體機制仍需進一步的研究，并且實驗中發(fā)現(xiàn)高劑量的SK存在一定的毒性作用，提示臨床應用SK及紫草相關(guān)制劑時需注意濃度。