王金，徐亞杰，喬助，任君

(湖北大學化學化工學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

氟化物在廣泛的生物、醫(yī)學和化學過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如牙科保健、骨質(zhì)疏松治療、供水治療，甚至化學武器.此外，氟化物很容易被人體吸收，但卻是緩慢吸收的.但是，過量的氟化物可能會引起蛋白質(zhì)損害，骨骼和甲狀腺活動紊亂方面的疾病[1-2].考慮到這些有害的因素，探尋一種簡單高效的方法來識別和檢測F-在實際應用中是必不可少的.因此，開發(fā)用于環(huán)境和生物系統(tǒng)中F-的特異性傳感和識別的有機小分子成為了一個非常熱門的課題.其中，熒光探針具有成本低、靈敏度高、檢測限低、合成簡單等優(yōu)點，還可用于活體細胞和體內(nèi)的檢測，在生物、化學和環(huán)境過程中的應用引起了人們的極大興趣[3-6].之前已經(jīng)有很多人報道過多種氟離子的熒光探針，但是大多數(shù)都是基于去質(zhì)子化的識別原理[7-11]，很難在含水相的體系中完成對氟離子的有效識別.而實際應用中，氟離子都是存在于含水體系中，因此，這一類氟離子熒光探針并沒有非常好的應用價值.而反應型的氟離子熒光探針[12-13]由于在含水的體系中仍然能夠很好地檢測氟離子，因此是我們的重點研究對象.基于此我們成功合成出了一種基于硅氧鍵的反應型氟離子熒光探針A，通過2-苯甲?；拎ず?-二乙胺基水楊醛合成出熒光探針分子A的熒光母體，我們以叔丁基二甲基氯硅烷作為我們熒光探針分子A的識別位點，通過各種表征和測試研究，驗證了其對于氟離子有著高效，高靈敏度的識別效果，并且具有裸眼識別的能力.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器試劑：2-苯甲?；拎?；4-二乙氨基水楊醛；醋酸銨；濃硫酸；冰乙酸；叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)；N-N二甲基甲酰胺；咪唑等試劑均為市售分析純，均無純化.

儀器：核磁測試中使用WIPM核磁共振波譜儀(中科院400 MHz)和Varian UNITY INOVA核磁共振波譜儀(美國600 MHz)，核磁測試中TMS作為我們的指定內(nèi)標物，測試核磁時全部采用氘代試劑.熒光測試時使用LS-55熒光分光光度計進行測試(美國Perkin-Elmer公司)；質(zhì)譜測試時使用質(zhì)譜用1260-6224 LC-MS TOF(安捷倫液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試儀)進行檢測.

1.2 合成過程如Scheme1所示，氮氣保護下，將4-二乙氨基水楊醛(0.96 g，5 mmol)溶解在10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室溫下持續(xù)攪拌直到4-二乙氨基水楊醛完全溶解，等到溶液澄清之后立即加入咪唑(0.544 g，8 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌半個小時，最后加入TBDMSCl(1.2 g，8 mmol)，油浴升溫至60 ℃反應4 h.TCL監(jiān)測待反應完成之后加入乙酸乙酯20 mL，然后用飽和氯化鈉溶液連續(xù)洗滌有機相3次(30 mL×3)，用無水硫酸鈉干燥有機相過夜，經(jīng)過抽濾，減壓旋蒸，最后將樣品通過洗脫液石油醚/乙酸乙酯(V∶V=10∶1)經(jīng)柱層析提純得到最后產(chǎn)物棕色油狀液體1.54 g，計算產(chǎn)率為78%.1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ=10.02(s,1H),7.61(d,J=8.00 Hz,1H),6.24(d,J=12.00 Hz,1H),5.88(s,1H),3.26～3.31(q,J=6.00 Hz,4H),0.93(s,9H),0.83(s,6H),0.19(s,6H);13C NMR(100 MHz,DMSO):δ=187.35,161.14,153.65,129.97,116.18,105.56,104.44,100.37,44.72,25.74,18.29,18.03,12.53,4.27.

Scheme 1 合成熒光探針分子A的路線過程圖

探針分子A的合成：將2-苯甲酰基吡啶(0.8 g，4.37 mmol)，化合物1(1.98 g，6.5 mmol)，醋酸銨(1.7 g，21.9 mmol)溶解于30 mL冰乙酸中，回流反應7 h.反應結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應液倒入冰水中，抽濾，得到大量固體產(chǎn)物，用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=4∶1)作為洗脫劑經(jīng)柱層析提純得到墨綠色晶體，產(chǎn)率為42%.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δ=8.14(d,J=12.00 Hz,2H),7.97(d,J=6.00 Hz,1H),7.88(d,J=12.00 Hz,1H),7.61～7.66(m,3H),7.43(t,J=6.00 Hz,1H),6.90(t,J=6.00 Hz,1H),6.65(d,J=6.00 Hz,2H),6.41(s,1H),3.53～3.57(m,J=6.00 Hz,4H),1.38(t,J=6.00 Hz,6H),0.92(s,9H);13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ=169.27,154.92,154.12,137.47,135.42,131.28,130.04,129.13,129.02,128.42,127.65,123.71,123.25,122.95,115.12,113.68,112.91,43.00,28.07,25.72,18.31,4.26;HR-MS(ESI):Calcd for C29H37N3OSim/z[M+H]+472.2706，F(xiàn)ound 472.120 8.

2 結(jié)果與討論

2.2 熒光探針A的選擇性分析對于熒光探針分子A的選擇性，我們?nèi)?2份1.5 mL的探針分子A的四氫呋喃溶液(2×10-5mol/L)，把其中一份設置成空白樣品，在剩下的11份探針分子A的四氫呋喃溶液中，同樣分別加入1.5 mL的2×10-4mol/L的11種常見的陰離子PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-).關(guān)于探針分子A的裸眼識別部分，首先在肉眼下觀察，如圖1所示，可以看到當只有加入F-之后樣品瓶中的溶液顏色才變?yōu)辄S綠色，剩下的樣品瓶中的顏色則為墨綠色.通過將樣品瓶放置于365 nm紫外燈下照射，可以得到圖2所示結(jié)果，加入F-之前的樣品瓶中的熒光為青色，而當加入F-之后熒光發(fā)生變化，變?yōu)辄S綠色.進一步探究探針分子A的選擇性分析，我們?nèi)?2份1.5 mL 2×10-5mol/L的探針分子A的四氫呋喃溶液，同樣把其中一份設置為空白樣品，在剩下的11份探針分子A的四氫呋喃溶液中，分別加入1.5 mL 2×10-4mol/L的11種常見陰離子的PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-)，通過熒光分光光度計分別進行掃描測試最后得到選擇性分析圖，如圖3所示，可以知道探針分子A對氟離子具有很高的選擇性識別能力.

圖1 探針分子A在不同離子下的比色變化圖

圖2 探針分子A在不同離子下的熒光變化圖

圖3 在THF/PBS buff(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對F-的選擇分析圖

2.3 熒光探針A的抗干擾能力分析為了探究探針分子A對氟離子的識別能力是否容易受到體外環(huán)境中離子的干擾，我們接下來進行了探針分子A的抗干擾實驗，干擾離子均是常見的Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、NO3-、AcO-、SO42-、H2PO4-、CN-等，通過配置不同濃度的常見離子PBS buffer溶液和探針分子A的四氫呋喃溶液，保證在我們的測試體系當中(THF/PBS=1∶1)探針分子A的當量∶氟離子的當量∶干擾離子的當量為1∶10∶100.首先我們分別量取1 mL探針分子A的四氫呋喃溶液11份，將其中一份設置為空白樣品，加入PBS buffer溶液1 mL，分別向剩下的10份樣品中加入等體積100當量的不同干擾離子溶液，用熒光分光光度計然后進行熒光強度掃描測試.同上，我們同樣取11份等體積的探針分子A的四氫呋喃溶液，設置一份空白樣，向其中加入0.5 mL PBS溶液，再向其中剩下的10份樣品瓶中分別加入等體積不同的干擾離子溶液，最后向每一份中樣品瓶中加入0.5 mL 的氟離子PBS buffer溶液，再次通過熒光分光光度計進行掃描.如圖4所示，結(jié)果表明探針分子A對氟離子的識別效果在存在100當量濃度的干擾離子之下依舊表現(xiàn)出十分優(yōu)良的檢測抗干擾性能.

圖4 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對F-識別的熒光強度干擾試驗圖

2.4 熒光探針A的滴定分析在THF/PBS=1∶1體系中，我們配置了6份1.5 mL的熒光探針分子A的四氫呋喃溶液，測試時我們分別向其中加入不同當量濃度的氟離子的四氫呋喃溶液(0～1 eq，其中1 eq代表2.0×10-5mol/L，下同)，然后通過對不同的氟離子當量濃度下的熒光探針分子A進行熒光圖譜掃描測試，最后可以得到如圖5所示的熒光探針分子A熒光強度隨著波長變化的熒光發(fā)射圖譜，可以看到隨著氟離子當量的逐漸加入，整個體系的最大發(fā)射波長發(fā)生了紅移現(xiàn)象，并且很明顯的看到探針分子A的熒光強度在不斷的降低，當加入的氟離子含量達到1 eq時，我們整個體系的熒光強度已經(jīng)達到最低數(shù)值，繼續(xù)增加離子的當量濃度，發(fā)現(xiàn)熒光強度基本不發(fā)生改變，結(jié)果表明氟離子與熒光探針分子A是按照1∶1的比例進行反應.為了計算得到熒光探針分子A對于氟離子的檢測限(DL)，我們通過origin對不同氟離子當量濃度下的最大熒光發(fā)射強度進行一維線性擬合，如圖6所示，整個體系擬合的線性回歸方程是y=-233.152 5x+288.1，之中y表示最高熒光發(fā)射峰所代表的熒光強度數(shù)值，x則是為F-的當量濃度數(shù)值，整個一維線性擬合得到的相關(guān)系數(shù)R2為0.994 67，按照IUPAC檢測限(DL)計算公式，DL=3σ/K[14-15]算得檢測限為4.26×10-8mol/L，這說明探針分子A對F-具有較低的檢測限.

圖5 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對F-的滴定分析圖譜

圖6 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A的熒光強度與F-濃度的線性關(guān)系圖

2.5 熒光探針A的響應時間傳感器的響應時間作為能否有更大應用價值的參考因素之一.在加入氟離子之后用LS-55熒光分光度計對探針分子A的溶液進行循環(huán)掃描測試，最后得到如圖7所示結(jié)果.可以看到探針分子C對氟離子的響應非常快，響應時間僅需40 s.

圖7 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對F-的響應時間

3 識別機理分析

通過比較氟離子加入前后的質(zhì)譜峰，可以進一步說明熒光探針分子A識別氟離子的機理，四丁基氟化銨被我們加入到探針分子A的溶液中，并且進行高分辨率質(zhì)譜測試,如圖8結(jié)果顯示探針分子A與四丁基氟化銨混合后在356附近出現(xiàn)了一超強峰.我們推測該峰是[C23H22N3O]的碎片峰(探針分子A的相對分子質(zhì)量減去含硅部分的相對分子質(zhì)量剛好是356).該結(jié)果驗證了探針分子A氟離子的識別作用是基于氟離子切斷硅氧鍵這一機理,與已有文獻[16]報道相吻合.

圖8 探針分子A(a)及其與四丁基氟化銨混合后(b)的質(zhì)譜圖

圖9 探針分子A對F-識別機理圖

4 結(jié)論

在本次實驗中，我們以苯甲?；拎ず?-二乙氨基水楊醛成功合成出熒光探針分子A的母體，在母體的基礎上叔丁基二甲基氯硅烷被我們采用作為識別氟離子的位點，最后通過合理的設計合成出了一種基于硅氧鍵斷裂為識別機理的熒光探針分子A，通過進一步的測試我們發(fā)現(xiàn)熒光探針分子A對氟離子識別表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度的特點.此外熒光探針分子A還可以實現(xiàn)對氟離子的裸眼識別，通過比較探針溶液加入氟離子的前后，我們發(fā)現(xiàn)在裸眼狀態(tài)下探針溶液的顏色，由氟離子加入之前的墨綠色變成氟離子加入之后的黃綠色；此外我們通過觀察在365 nm紫外燈下探針溶液加入氟離子的前后的裸眼熒光變化，發(fā)現(xiàn)在裸眼狀態(tài)下探針溶液的熒光由氟離子加入之前的青色變?yōu)榉x子加入之后的黃綠色.經(jīng)過進一步熒光分光光度計檢測熒光探針分子A的性能，結(jié)果表明熒光探針分子A可以很好地識別選擇氟離子和表現(xiàn)出很好的抗干擾能力，檢測限達到了DL=4.26×10-8mol/L，并且對氟離子的識別十分迅速，響應時間只有40 s.