余小芳，曹逸非，張珊珊，彭帆，陳懷俠

(湖北大學化學化工學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

水楊酸(鄰羥基苯甲酸，salicylic acid，2-HBA)是重要的醫(yī)藥中間體和精細化工原料，常用于制備阿司匹林、抑氮磺胺、水楊酸鈉、水楊酸偶氮磺胺二甲嘧啶、二氟苯水楊酸、水楊酰胺、乙氧酰苯氨、撲炎痛、水楊酸萘酯、羅匹寧、乙酰水楊酰胺、沙利芬、芬胺呋和醋醚水楊胺等醫(yī)藥產(chǎn)品.水楊酸具有去角質(zhì)和清理毛孔的作用，廣泛用于醫(yī)療保養(yǎng)品，有很好的淡化色素斑、縮小毛孔、去除細小皺紋及改善日曬引起的老化等效果，安全性較高，對皮膚的刺激低.因此，作為典型的藥物與個人日用品，水楊酸成為環(huán)境水體中的新型微污染物.而人體攝入過量的水楊酸會刺激消化道而產(chǎn)生食道的黏膜和內(nèi)膜的毒副作用，并能與機體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應，產(chǎn)生腐蝕作用，從而引起腹瀉、嘔吐、腹痛、酸中毒、呼吸頻促等癥狀[1].所以，環(huán)境水體中的水楊酸殘留會造成人類的健康危害[2].因此，建立一種簡便快速、高靈敏度的方法進行環(huán)境水體中水楊酸的測定尤為重要[3-5].

水楊酸的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]、氣質(zhì)聯(lián)用法[8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]等.其中，液相色譜法具有對分析物熱穩(wěn)定性、沸點和分子量沒有限制的特點而得到廣泛應用，但是選擇性靈敏度有限.而樣品前處理可以有效提高該方法的靈敏度和選擇性.分子印跡聚合物能夠?qū)δ０暹x擇性的吸附富集，滿足分析的需要，在樣品前處理中的應用得到了迅速發(fā)展.分子印跡技術具有高選擇性[10-14]，與整體柱材料[15-17]相結合即成為分子印跡整體柱，合成簡單，省去了研磨、過篩、填料等一系列復雜過程，重復性好，柱壓低，為快速傳質(zhì)提供了便利.S.G.Dmitrienko等考察了分子印跡聚合物對水楊酸及其酯類的選擇性吸附能力，獲得了較好的結果[18]，但目前還鮮見水楊酸分子印跡有機聚合物整體柱固相微萃取研究的報道.

本研究以水楊酸為模板分子，采用原位聚合法，在移液槍小槍頭中合成了水楊酸分子印跡整體微柱，并對分子印跡聚合物進行了表征和固相微萃取應用研究.考察了合成條件和萃取條件，建立了環(huán)境水樣中水楊酸的SPME-HPLC定量分析方法.該方法簡單方便、選擇性好、靈敏度高，分離富集效果好，適用于環(huán)境樣品中水楊酸殘留的分析測定.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑Dionex ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；PDA-3000 光電二極管矩陣檢測器(美國Dionex公司)；Amethyst-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱(美國Sepax Technologies，DE)；BS210S分析天平(北京賽多斯天平有限公司)；超聲清洗儀(美國Branson公司)；100～1 000 μL可調(diào)式移液器(上海熱電儀器有限公司)；蘭格LSP01-1A型注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；X-650 掃描電子顯微鏡(日本日立電子電氣公司)；WH-3 微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；DZF-6021 型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；AWJ1-0501-U 型超純水機(艾科浦公司)；移液槍槍頭(4*49，200 μL).

水楊酸(2-HBA，分析純)購自廣州化學試劑廠；對羥基苯甲酸(PHBA，分析純)購自北京化工廠；甲硝唑(MNZ，分析純)購自中國生物藥品制品檢驗所；甲苯和十二醇(分析純)均購自天津市富晨化學試劑廠(分析純，使用前減壓蒸餾處理)；4-乙烯基吡啶(4-VP，95%)購自美國Acros公司；丙烯酰胺(AM)購自武漢市華順生物技術有限公司(使用前重結晶)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購自美國Acros公司(先用5%NaOH溶液萃取3次，再用超純水洗去多余的NaOH，最后用無水MgSO4干燥后使用)；偶氮二異丁腈(AIBN，化學純)購自上海試劑四廠(使用前用無水乙醇重結晶)；甲醇和乙腈(色譜純)均購自美國Tedia公司；超純水.

標準儲備液的配制：配制1.0 mg/mL的水楊酸的甲醇溶液，4 ℃冷藏儲存.

標準溶液的配制：用超純水稀釋水楊酸儲備液而制得，現(xiàn)配現(xiàn)用.

樣品溶液的配制：分別取自來水、長江水和沙湖水，用0.22 μm的濾膜過濾兩次后于4 ℃冰箱冷藏儲存.

1.2 聚合物整體柱的合成水楊酸分子印跡聚合物整體柱(MIP)的合成：7.2 mg(0.05 mmol)水楊酸充分溶解于360 μL十二醇和45 μL甲苯中，加入21 μL(0.2 mmol)4-VP，超聲預聚合4 h，加入170 μL(0.9 mmol)EGDMA和8 mg AIBN，溶解均勻后超聲脫氣10 min，立即轉(zhuǎn)至200 μL規(guī)格的移液槍頭中并將兩端密封，置于真空干燥箱60 °C反應24 h.反應完成后，用甲醇將洗盡模板分子和雜質(zhì)，用超純水平衡后備用.

非印跡聚合物整體柱 (NIP)的合成：除不加入水楊酸外，其他步驟同上.

1.3 MIP-PMME過程用5 mL甲醇清洗印跡柱，以1 mL超純水活化.取5 mL樣品溶液以0.15 mL/min的流速上樣后，用500 μL超純水清洗，再用80 μL乙腈∶水(90∶10)混合液洗脫，洗脫液直接進行HPLC分析.

1.4 分子印跡整體柱選擇性的考察2 mL 400 ng/mL水楊酸、對羥基苯甲酸和甲硝唑混合水溶液，以0.10 mL/min的流速分別用印跡柱和非印印跡柱進行萃取，經(jīng)500 μL超純水清洗后，用100 μL甲醇洗脫后直接進行HPLC分析，通過比較印跡柱和非印跡柱對目標物及非類似物的富集能力來評價分子印跡柱的選擇吸附性.

1.5 色譜條件色譜柱：Amethyst C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇∶ 0.05%甲酸水溶液為70∶30 (V∶V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：100 μL；檢測波長：2-HBA為235 nm、PHBA為256 nm、MNZ為320 nm.

2 結果與討論

2.1 合成條件的優(yōu)化合成條件改變影響著合成的分子印跡聚合物的形態(tài)特征和選擇性吸附能力.本文中主要研究以水楊酸為模板分子合成時選擇不同的功能單體的影響并優(yōu)化了模板分子與功能單體比例.

2.1.1 功能單體的選擇 由于水楊酸為酸性化合物，為了使分子印跡整體柱獲得較好的識別選擇性，所以選擇堿性或中性功能單體.本實驗分別考查了AM、4-VP為功能單體時聚合物整體柱的選擇性和富集能力.

0.05 mmol水楊酸、0.2 mmol不同的功能單體，360 μL十二醇和45 μL甲苯為致孔劑，170 μL (0.9 mmol)交聯(lián)劑EGDMA、8 mg引發(fā)劑AIBN置于真空干燥箱60 ℃反應24 h.分別比較不同功能單體對印跡柱選擇性和富集效果的影響，結果如表1.顯然，當4-VP為功能單體時，水楊酸印跡整體柱選擇性好，而AM為功能單體時，整體柱富集能力較強，綜合考慮，后續(xù)實驗選擇4-VP為功能單體.

表1 2-HBA的功能單體對MIP整體印跡因子的影響

2.1.2 模板分子與功能單體比例的優(yōu)化功能單體的選擇 功能單體與模板分子的比例直接影響印跡聚合物整體柱的識別性能，當功能單體的量過多而模板分子過少時,聚合物的識別位點數(shù)量減少，識別能力差，選擇性差，同時非特異性吸附嚴重；相反，若功能單體偏少而模板分子過多，也不能形成豐富的分子識別位點，同時會造成模板分子的浪費，所以必須對模板分子與功能單體的比例進行優(yōu)化.

本研究根據(jù)模板分子水楊酸與功能單體4-VP的結構推出反應的大致比例，然后選取了水楊酸與4-VP摩爾比分別為1∶2和1∶4進行了比較，結果見表2.可見，當模板分子與功能單體為1∶4時，印跡柱的印跡因子更大，這可能是由于功能單體的量增多時，能與模板分子充分預聚合，識別位點增加.但功能單體過多，印跡柱的非特異性吸附將相應增加，選擇性會下降，故后續(xù)實驗選擇模板分子與功能單體的比例為1∶4.

表2 模板與功能單體的摩爾比對2-HBA MIP單體印跡因子的影響

2.2 聚合物整體柱結構表征及選擇性考察水楊酸分子中的羧基和羥基氫均能夠與4-VP分子中的N原子形成氫鍵，加入交聯(lián)劑將這種作用記憶下來，合成結束，去除模板水楊酸分子，聚合物整體柱中就形成了與水楊酸分子空間尺寸和化學結構相匹配的位點空穴，從而對水楊酸具有選擇性的分子識別，其作用機理見圖1.

圖1 MIP的印跡工藝示意圖

圖2 2-HBA、4-VP、MIP和NIP的FT-IR光譜

用掃描電鏡對水楊酸分子印跡聚合物整體柱的形貌特征進行了表征，見圖3.顯然，聚合物中存在著較多不同尺寸的微孔，這些微孔相互連通形成整體柱的雙連續(xù)結構，從而具有很好的滲透性，為整個萃取過程快速順利的完成提供了有利條件.

圖3 MIP整體的SEM圖像(放大倍數(shù)5 000倍)

為了表征分子印跡整體柱的選擇性，將印跡柱和非印跡柱作比較，同時考察了他們對模板分子水楊酸及其類似物對羥基苯甲酸和非類似物甲硝唑的吸附作用.結果如圖4所示，和非印跡柱相比，印跡柱對模板及其類似物具有良好的吸附性，且對模板具有更高的吸附能力，而印跡柱和非印跡柱對非類似物的吸附能力相當，即該印跡柱對水楊酸具有很好的選擇性和富集能力.

圖4 MIP、NIP對2-HBA、4-HBA和MNZ富集倍數(shù)(5 mL 50 ng/mL樣品溶液，80 μL 90∶10的乙腈∶水混合液洗脫)

2.3 MIP-PMME條件的優(yōu)化對于分子印跡聚合物整體柱微萃取來說，影響萃取效率的因素主要有樣品pH、體積和流速，以及洗脫劑種類和體積等.使用 100 ng/mL 的水楊酸標樣對上述因素進行了優(yōu)化.

目前還沒有環(huán)境水樣中水楊酸殘留量的標準出臺，本方法的選擇性很高，檢測限達到ng/mL數(shù)量級，滿足環(huán)境微污染物定量分析的要求.

2.3.1 上樣pH的影響 恒定樣品體積為5 mL，分別用磷酸調(diào)節(jié)樣品pH為2～6，上樣后用100 μL甲醇進行洗脫進樣，結果如圖5(A).可見，溶液pH增大時，回收率降低，這可能是由于水楊酸的pKa為2.98，當pH小于3時，水楊酸以分子形態(tài)存在，更容易被印跡位點識別，故后續(xù)的實驗選擇pH=2為最佳酸度條件.

2.3.2 上樣體積的影響 分別上樣5、6、7、8、9 mL，考察樣品體積對提取效率的影響，見圖5(B).可見，隨著上樣體積的增大，回收率不斷下降，選擇5 mL為合適的樣品體積.

2.3.3 萃取流速的影響 上樣5 mL，流速在0.05～0.30 mL/min之間變化時，提取效率見圖5(C).可見，當流速為0.15 mL/min時萃取效率最好，故后續(xù)實驗中上樣流速均選擇為0.15 mL/min.

2.3.4 洗脫劑種類的影響 將5 mL 100 ng/mL pH=2的水楊酸水溶液以0.10 mL/min的流速通過分子印跡整體柱，然后用500 μL的水清洗，再用100 μL的不同洗脫劑洗脫.考慮到與高效液相色譜流動相的一致性，考察了甲醇和水、乙腈和水為洗脫劑時的回收率.如圖5(D)，5(E)無論是使用甲醇和水或者乙腈和水混合液做洗脫劑，回收率都隨著水比例的增加先上升后下降，而且乙腈比甲醇有更好的洗脫能力，當洗脫劑為乙腈和水為9∶1時，回收率達到最高，最終選擇洗脫劑為乙腈和水為9∶1(V∶V).

2.3.5 洗脫劑體積的影響 將5 mL 100 ng/mL水楊酸水溶液以0.15 mL/min通過水楊酸分子印跡整體柱，用500 μL的水清洗，再分別用50、70、80、100和150 μL的洗脫液洗脫.結果如圖5(F).顯然，隨著洗脫液體積的增加，回收率增加，當洗脫液體積增加到80 μL后，回收率變化不大，所以選擇80 μL的乙腈和水(9∶1)為合適的洗脫劑.

圖5 上樣條件及洗脫條件優(yōu)化

2.4 方法評價圖6為空白自來水樣品分析、樣品添加350 ng/mL的水楊酸直接HPLC分析與MIP-PMME-HPLC分析的色譜圖，顯然，該印跡柱對水楊酸有很好的分離富集效果.

圖6 自來水中2-HBA的HPLC色譜圖2-HBA樣品溶液添加到350 ng/mL；HPLC條件∶流動相，MeOH- 0.05%甲酸(70∶30,V/V)(1) MIP-PMME后的自來水;(2)添加了雜質(zhì)的自來水;(3) MIP-PMME后添加的自來水

分別以3倍和10倍信噪比計算檢出限和定量限，得到自來水、長江水和沙湖水中水楊酸的檢出限為1.2 ng/mL，定量限為4.0 ng/mL.該方法的重現(xiàn)性如表3，日間精密度為連續(xù)4 d分別對添加含量為10、100、350 ng/mL自來水、長江水和沙湖水樣品進行萃取所得.日內(nèi)精密度為同一天內(nèi)分別對同上述濃度樣品3次測定所得.結果表明，方法重復性良好，日內(nèi)小于8.1%，日間小于9.8%，滿足常規(guī)分析要求.

2.5 實際樣品分析對本實驗室自來水、長江水和沙湖水進行MIP-PMME-HPLC分析，均未檢出水楊酸.為了考察MIP-PMME-HPLC方法對檢測水樣中水楊酸的適用性和可靠性，分別對空白樣品中加入高、中、低3種濃度的水楊酸，空白水樣中的加標濃度分別為10、100、350 ng/mL，結果見表3.該方法對水楊酸在水樣中的加標回收率分別為92.1%～105.8%.

表3 MIP-PMME-HPLC法測定自來水、長江水和沙湖水中2-HBA的回收率、準確度、LODs和LOQs

3 結論

優(yōu)化合成條件，以水楊酸為模板分子，4-VP為功能單體，在模板分子∶功能單體∶交聯(lián)劑為1∶4∶18的最佳條件下，運用原位聚合法在移液槍頭中合成了水楊酸印跡聚合物整體柱，是良好的吸附傳質(zhì)介質(zhì).而且，材料合成步驟簡單，對水楊酸有較強的選擇性吸附能力.優(yōu)化上樣溶液pH、體積、萃取流速、洗脫劑種類、體積等萃取條件后，建立了SPME-HPLC定量分析方法，對環(huán)境水樣進行了測定，水樣中水楊酸在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限(LOD)為 1.2 ng/mL，回收率的范圍在 92.1%～105.8% 之間，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于 9.8%.該方法簡單快速、選擇性高、靈敏度高，適合于環(huán)境水樣中水楊酸的分離分析.