張珊珊，曹逸非，彭帆，余小芳，陳懷俠

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

柚皮苷(Naringin，NRG)和橙皮苷(Hesperidin，HPD)是一種廣泛存在于柑橘類水果中的類黃酮物質(zhì)，這類物質(zhì)具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，如抗炎、抗病毒、抗癌、抗突變、抗過敏、抗?jié)?、?zhèn)痛、降血壓、降膽固醇、減少血栓的形成等.該類藥物能夠改善局部微循環(huán)和營養(yǎng)供給，可用于防治心腦血管疾病.在食品工業(yè)中可用作天然抗氧化劑，也可用于化妝品行業(yè)[1-3].

生物樣品中NRG和HPD分析是該類藥物藥理研究基礎(chǔ).目前，生物樣品中柚皮苷和橙皮苷分析方法主要有薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)[4]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5-6]和氣相色譜法(gas chromatography，GC)[7]以及聯(lián)用技術(shù)等[8].

生物樣品組成復(fù)雜，內(nèi)源性物質(zhì)、藥物代謝產(chǎn)物等干擾成分多，目標(biāo)物含量低，樣品的前處理是其定量分析的關(guān)鍵步驟[9].固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)無需有機(jī)溶劑、萃取簡便快速、操作簡單、可進(jìn)行現(xiàn)場分析[10-12].吸附劑的吸附性能是SPME研究的重點(diǎn).有機(jī)聚合物整體柱制備方便，具有骨架和穿透孔雙連續(xù)結(jié)構(gòu)，傳質(zhì)阻力小，柱壓低，生物兼容性好的特點(diǎn)，所以有機(jī)聚合物整體柱是SPME的理想吸附劑.已經(jīng)有聚合物整體柱固相微萃取的研究報道[13-15]，但這些微柱合成于毛細(xì)管或塑料毛細(xì)管中，整體柱易斷裂，使用壽命有限[16].目前，未見尿樣中NRG和HPD聚合物整體柱微萃取的研究報道.

本研究通過合成條件的優(yōu)化，在移液槍小槍頭內(nèi)制備聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯，AA-EGDMA)整體柱，通過SPME條件的優(yōu)化，將該微柱應(yīng)用于尿樣中NRG和HPD分離富集，建立了尿樣中NRG和HPD的SPME-HPLC分離分析方法.結(jié)果顯示，該方法操作簡單、靈敏度和準(zhǔn)確度高.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料柚皮苷(NRG，供含量測定用)和橙皮苷(HPD，供含量測定用)均購于中國藥品生物制品鑒定所；色譜純甲醇和乙腈(美國Fisher公司)；甲基丙烯酸(MAA，使用前減壓蒸餾純化)；丙烯酰胺(AM，使用前減壓蒸餾)；(丙烯酸(AA，使用前減壓蒸餾)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，美國Sigma公司，使用前用NaOH溶液萃取，再用超純水洗后用無水MgSO4干燥)；偶氮二異丁腈(AIBN，上海試劑四廠，化學(xué)純，使用前用無水乙醇重結(jié)晶)；分析純甲苯、十二醇(使用前減壓蒸餾)；水(超純水).其他試劑均為分析純，所有的溶液均在4 ℃下避光保存.

1.2 儀器及色譜條件Dionex ultimate 3000 HPLC配有二極管陣列檢測器(PAD)(Dionex公司，美國)；Acclaim-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm,美國Dionex公司)，配有材料相同的保護(hù)柱(2.1 mm×12.5 mm,5 μm，美國Agilent公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；蘭格 LSP01-1A型注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；TGL 16 M型湘智離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；移液槍槍頭(4*49，200 μL)；WH-3微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠).

色譜流動相：甲醇∶水(40∶60,V/V)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；20 μL定量環(huán)；檢測波長為283 nm.

1.3 聚合物整體柱的制備聚合物整體柱通過熱引發(fā)聚合的方法合成于移液槍頭(4*49，200 μL)中.將AM(50 μL，50 mg)、EGDMA(420 μL，440 mg)、甲苯(130 μL)和十二醇(860 mg)和AIBN(4.5 mg)預(yù)聚混合液混勻并超聲5 min.然后取50 μL預(yù)聚液灌入經(jīng)甲醇清洗且一端密封的移液槍頭中，用硅橡膠將另一端密閉，60 ℃反應(yīng)24 h，得聚合物整體柱.用甲醇反復(fù)沖洗整體柱，除去制孔劑與未反應(yīng)單體等雜質(zhì)，備用.

1.4 固相微萃取過程整體柱固相微萃取步驟分為活化、萃取和解吸3個步驟，見圖1.

圖1 SPME過程

活化：用注射器吸取1.0 mL甲醇，用微量注射泵以1.0 mL/min 的流速推過萃取柱；再吸取0.2 mL的超純水以相同的流速推過萃取柱.

萃?。何?.0 mL樣品溶液以0.05 mL min-1的流速推過萃取柱.然后吸取0.2 mL的超純水以同樣的速度推過萃取柱，以清洗雜質(zhì).

解吸：吸取60 μL 80∶20的甲醇-水解析液以0.05 mL min-1的流速推過萃取柱，收集洗脫液，用于HPLC分析.

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別配制1 mg/mL NRG和HPD的甲醇儲備液，實(shí)驗(yàn)前分別用超純水稀釋，配制所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及NRG、HPD的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

樣品溶液的配制：取健康青年人尿樣，加超純水稀釋10倍，用0.22 μm的濾膜過濾，避光保存于4 ℃，24 h內(nèi)處理分析.

1.6 線性關(guān)系的考察取空白尿樣分別添加10、15、50、500、2 000、5 000、10 000 ng/mL NRG和HPD，進(jìn)行SPME-HPLC分析，獲得峰面積和濃度之間的線性關(guān)系，同時進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個濃度重復(fù)3次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取回收率的計算本實(shí)驗(yàn)以萃取回收率(ER)為評價指標(biāo)，考察整體柱的吸附性能.其定義如下：

式中，Velu和Celu分別為洗脫液體積及其濃度，Vaq和Co分別為上樣溶液的體積及其濃度.

2.2 合成條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)按聚合物整體柱制備方法，制備不同功能單體和不同溶劑的整體柱，考察單體和溶劑對整體柱萃取性能的影響.結(jié)果見表1，可見聚(丙烯酰胺-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱柱壓大，無法控制樣品流速，難以實(shí)現(xiàn)SPME.聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱萃取效率要遠(yuǎn)高于聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱.而功能單體均為丙烯酸時，甲苯/十二醇混合溶劑要比甲苯/乙腈混合溶劑制備的整體柱對兩種分析物的分離富集效果好.故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇以甲苯/十二醇混合溶劑制備的聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱.

表1 整體柱合成條件的優(yōu)化

2.3 聚合物整體柱的表征以掃描電鏡表征聚合物整體柱的物理形貌，見圖2.可見，聚合物整體柱內(nèi)部是微球顆粒的連續(xù)聚合體，有微米級的大孔(通孔)結(jié)構(gòu)以及小孔，即該整體柱具有典型的骨架和孔道雙連續(xù)性.

圖2 聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱掃描電鏡圖

2.4 SPME條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)以50 ng/mL NRG和HPD的混合溶液考察了SPME的洗脫液種類、樣品溶液流速、體積、pH值及離子強(qiáng)度對ER的影響.

2.4.1 洗脫液種類和配比的選擇 按照SPME步驟，考察甲醇-水和乙腈-水體積比分別為20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0的洗脫效果.結(jié)果見圖3(A)和(B).由圖可見，總體來說，甲醇-水比乙腈-水洗脫效果好.80∶20甲醇-水和純甲醇的洗脫效果相當(dāng)，但純甲醇洗脫液色譜峰對稱性較差.所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇80∶20的甲醇-水混合液進(jìn)行洗脫.

2.4.2 樣品流速的選擇 分別用0.05～0.4 mL/min的流速進(jìn)行SPME的上樣,考察樣品流速對萃取效率的影響，結(jié)果見圖3(C).可見，樣品流速增加，萃取效果降低，但樣品流速太慢時，分離時間增加，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品的流速為0.05 mL/min.

2.4.3 樣品體積的選擇 以1、2、3、4、5 mL NRG、HPD混合樣品溶液進(jìn)行萃取，考察樣品體積對萃取效率的影響.由圖3(D)可見，樣品溶液體積的增加時，HPD回收率變化不大，NRG回收率逐漸增加.綜合考慮實(shí)驗(yàn)速度和回收率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5 mL樣品溶液進(jìn)行分析.

2.4.4 樣品溶液酸度的選擇 酸度是影響萃取效率的重要因素.用磷酸調(diào)節(jié)樣品溶液的酸度，在pH 2～7范圍內(nèi)考察樣品pH值對萃取效果的影響.結(jié)果見圖3(E).顯然，隨著樣品溶液酸度的增加，萃取效果變差.這主要是因?yàn)殡S著酸度的增加，NRG和HPD穩(wěn)定性下降，因此本實(shí)驗(yàn)選擇不改變樣品溶液pH值.

2.4.5 離子強(qiáng)度的選擇 向樣品溶液中分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%(質(zhì)量百分濃度)固體NaCl，考察鹽度對萃取效率的影響.由圖3(F)可見，增加NaCl的加入量，萃取回收率下降，同時，柱壓也逐漸變大.故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品中不添加NaCl.

圖3 甲醇-水解析液的配比(A)，乙腈-水解析液的配比(B)，樣品流速(C)，樣品體積(D)，樣品溶液酸度(E)和樣品溶液離子強(qiáng)度(F)對ER的影響

2.5 方法的考察和樣品分析

2.5.1 方法的考察 按工作曲線制作方法，配制空白尿樣加標(biāo)不同濃度NRG和HPD的溶液，進(jìn)行SPME-HPLC分離分析，獲得線性方程.分別以信噪比等于3和10獲得方法的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 線性范圍和檢測限、定量限

在空白尿樣中分別添加高、中、低濃度的NRG和HPD，計算方法的加標(biāo)回收率，見表3.可見，該方法對NRG和HPD的加標(biāo)回收率分別為83.5%～110.1%和82.6%～106.1%.日內(nèi)RSD小于6.7%，日間RSD小于7.8%.

表3 方法的加標(biāo)回收率(n=3)

由表4可見，和其他方法進(jìn)行比較，本方法線性范圍寬，檢測限低.

表4 本方法與其他相關(guān)研究的比較

2.5.2 尿樣分析 將該SPME-HPLC方法應(yīng)用于健康人尿樣中NRG和HPD的檢測分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未檢出分析物.在優(yōu)化的SPME條件下，對添加NRG和HPD標(biāo)準(zhǔn)品的空白尿樣進(jìn)行SPME- HPLC分析，結(jié)果見圖4.可見，該方法對NRG和HPD具有較好的分離富集效果，樣品基質(zhì)不干擾分析.

圖4 空白尿樣加標(biāo)50 ng·mL-1 NRG和HPD SPME前(1)和后(2)的SPME-HPLC圖

3 結(jié)論

本研究合成了聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯，AA-EDGMA)整體柱，成功用于SPME-HPLC檢測尿樣中NRG和HPD.該方法線性好，精密度高，檢出限低，為尿樣中類黃酮類化合物的分離和檢測提供了有效方法.