彭帆，譚雨嫣，張珊珊，余小芳，陳懷俠

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPPs)品種多且藥效高，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用來控制害蟲和保護(hù)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品.OPPs多為磷酸酯類或硫代磷酸酯類，進(jìn)入體內(nèi)會(huì)與膽堿酯酶結(jié)合使其失去水解乙酰膽堿的能力，從而引起生理功能紊亂，也可誘發(fā)其他疾病而嚴(yán)重影響人類的健康.因?yàn)橛袡C(jī)磷農(nóng)藥價(jià)格相對(duì)較低，控制害蟲、雜草的效能高，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在著違法大量使用OPPs殺蟲劑的現(xiàn)象[1-4].因此，建立快速簡(jiǎn)便、靈敏可靠檢測(cè)食品中OPPs殘留的分析方法十分重要.

目前，測(cè)定食品基質(zhì)中OPPs農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[5].其中，GC對(duì)沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差和極性強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥分析有一定的局限性，GC-MS和LC-MS儀器昂貴，測(cè)試成本較高，不易普及.HPLC操作簡(jiǎn)便，對(duì)分析物的沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性和極性沒有限制，應(yīng)用廣泛.食品和果蔬樣品組成復(fù)雜、農(nóng)藥殘留含量低，樣品前處理可以有效改善HPLC靈敏度和選擇性[4].

液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)和固相微萃取(SPME)[6-7]都曾用于從不同基質(zhì)中分離富集OPPs.然而，液液萃取需要大量的有毒溶劑，固相萃取選擇性有限，固相微萃取的萃取纖維昂貴而易碎，限制了其使用壽命.液相微萃取(LPME)被看作是溶劑最小化的樣品前處理方法，不需要昂貴的設(shè)備，操作簡(jiǎn)便快速，而且很少接觸有毒溶劑，但液滴穩(wěn)定性差、精密度和靈敏度相對(duì)較低[8].分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)是一種新型液液微萃取方法[9]，即將萃取劑完全分散在樣品溶液中以擴(kuò)大萃取劑和溶液的接觸面積，可以在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到萃取平衡.因而，該方法回收率和富集倍數(shù)高、操作簡(jiǎn)單、萃取速度快，被廣泛關(guān)注[10].DLLME常用鹵代烴為萃取溶劑，毒性較大.因此，尋找毒性較低的新型萃取溶劑是DLLME研究的方向.離子液體(ionic liquids，ILs)是指在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的、完全由陰陽離子所組成的鹽.常見的陽離子有咪唑鹽離子、季銨鹽離子和吡咯鹽離子等陰離子部分主要以鹵素離子和其他無機(jī)酸離子為主.離子液體具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，熱穩(wěn)定性好、溶解能力強(qiáng)、環(huán)境友好，被稱為綠色溶劑.將室溫離子液體作提取劑應(yīng)用到分散液液微萃取中，避免使用高毒溶劑，也擴(kuò)大了分散液液微萃取法的應(yīng)用范圍.目前，IL-DLLME已應(yīng)用于不同樣品中農(nóng)藥殘留的分離富集，如水、茶葉、土壤、水果等[4,11-16].

本研究以咪唑類離子液體[C6MIM][PF6]為萃取劑，對(duì)蘋果中噠嗪硫磷、對(duì)硫磷、倍硫磷和伏殺硫磷進(jìn)行DLLME，在優(yōu)化的萃取條件下，建立了蘋果中4種有機(jī)磷農(nóng)藥多組分同時(shí)定量分析的IL-DLLME-HPLC方法，進(jìn)行了方法的考察并應(yīng)用于蘋果樣品中4種有機(jī)磷農(nóng)藥(噠嗪硫磷、對(duì)硫磷、倍硫磷和伏殺硫磷)的測(cè)定，結(jié)果滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑Dionex Summit 680 HPLC儀(美國Dionex公司)并配有Chromeleon色譜管理軟件及紫外檢測(cè)器(UV-170)，手動(dòng)進(jìn)樣器(大連依利特公司)配5 μL定量環(huán)；柱溫箱(LGC-1025M，荊州市楚新電子產(chǎn)品開發(fā)有限公司)；80-2型離心機(jī)(江蘇電子儀器公司)；WH-3微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；DL-01溶劑過濾器(DL01真空泵+FB01T過濾瓶，天津市東康科技有限公司)；Aquaplus超純水制水儀(AWJ1-0501-U，艾科浦公司)；pHS-25型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；B-200超聲波清洗器(美國Branson公司)；0.22 μm和0.45 μm濾膜和微孔過濾器(上海興亞凈化材料廠)；可調(diào)式移液器(10～50 μL和50～100 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司；Finnpipette100-1 000 μL，上海熱電儀器有限公司).

噠嗪硫磷(pyridaphenthion，99.0%)、對(duì)硫磷(parathion，99.5%)、倍硫磷(fenthion，99.2%)和伏殺硫磷(phosalone，99.0%)購于美國Dima科技公司，離子液體([C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6]，99.0%)購于上海成捷化學(xué)有限公司，色譜純甲醇和乙腈(Tedia公司，美國)，水(超純水)，分析純丙酮、氯化鈉、無水硫酸鎂、磷酸等.

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以甲醇為溶劑配制濃度為3 mg/mL的噠嗪硫磷、對(duì)硫磷、倍硫磷和伏殺硫磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.以超純水適當(dāng)稀釋儲(chǔ)備液配制濃度為50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.所有溶液均在4 ℃條件下避光保存.

1.2 色譜條件色譜柱：Varian Pursuit-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Varian Technologies，PaloAlto，CA，美國)，配有相同填料的預(yù)柱(2.1 mm×12.5 mm，5 μm，Agilent Technologies，PaloAlto，CA，美國)，流動(dòng)相：甲醇-水(80∶20，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：251 nm和284 nm.

1.3 樣品的處理新鮮蘋果樣品購于當(dāng)?shù)爻?，用食品粉碎機(jī)粉碎.稱取5.0 g樣品于20 mL離心管中，加入10 mL乙腈，充分振蕩1 min，加入2.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，漩渦振蕩，在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，濾液在40 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)近干，殘?jiān)?0 mL超純水超聲溶解后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液用于IL-DLLME.

1.4 IL-DLLME過程取5.0 mL樣品溶液置于10 mL離心管中，用1 mL注射器將包含0.7 mL甲醇和60 μL[C6MIM][PF6]的混合液噴射到樣品溶液中，輕輕搖動(dòng)離心管，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心8 min，除去上層水相，用50 μL甲醇稀釋沉淀相，稀釋液用于HPLC分析.

1.5 工作曲線的制作在空白蘋果樣中分別添加濃度為20、100、500、1 000、1 500、2 000 μg/kg的4種有機(jī)磷，按樣品處理方法制備樣品溶液.用于DLLME-HPLC分析，獲得濃度和峰面積之間的線性關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

優(yōu)化DLLME條件時(shí)，以回收率(extraction recovery，ER)評(píng)價(jià)萃取效率.

式中C0為樣品溶液濃度，Csed為沉淀相濃度，Vaq為樣品溶液體積，Vsed為沉淀相體積.

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑的選擇 合適的萃取溶劑是保證IL-DLLME萃取效率的前提.咪唑類離子液體常被用作萃取溶劑，本實(shí)驗(yàn)選用兩種咪唑類離子液體[C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6]為萃取劑.取用0.7 mL甲醇分別和60 μL離子液體混合進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取后[C6MIM][PF6]和水相有效分離，而[C4MIM][PF6]無法分離，這可能是因?yàn)閇C4MIM][PF6]水中溶解度(18.8 g/L)遠(yuǎn)大于[C6MIM][PF6](7.5 g/L)，60 μL的[C4MIM][PF6]完全溶于水中.后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用[C6MIM][PF6]為萃取劑.

2.1.2 分散劑的選擇 分散劑在萃取劑和水中的混溶性是選擇分散劑的依據(jù).本實(shí)驗(yàn)分別以0.7 mL甲醇、乙腈、丙酮為分散劑，60 μL[C6MIM][PF6]為萃取劑混合進(jìn)行萃取.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇為分散劑時(shí)的回收率比乙腈好(如圖1)，而丙酮自身有很強(qiáng)的紫外吸收，對(duì)目標(biāo)物分析有干擾.故選擇甲醇為分散劑.

圖1 分散劑種類對(duì)回收率ER的影響

2.1.3 離子液體體積的影響 固定甲醇體積為0.7 mL，考察離子液體為30～80 μL時(shí)的回收率.結(jié)果表明，隨著離子液體體積的增加，沉淀相的體積也在增加.當(dāng)體積為30 μL時(shí)，無沉淀相產(chǎn)生.如圖2(a)所示，從40 μL到80 μL變化時(shí)，萃取回收率先增加后降低，在體積為60 μL時(shí)回收率最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)離子液體體積選擇60 μL.

2.1.4 分散劑體積的影響 分散劑體積的改變會(huì)改變沉淀相的體積，因而影響回收率.本實(shí)驗(yàn)考察甲醇體積在0.4～1.0 mL范圍內(nèi)的影響.隨著甲醇體積的增加，沉淀相體積減少，回收率的變化是先升高再降低，如圖2(b)所示.0.7 mL甲醇具有最好的回收率，故選擇0.7 mL甲醇為分散劑.

2.1.5 萃取溫度的影響 萃取溫度不同也會(huì)影響回收率，為此，本實(shí)驗(yàn)考察了3～40 ℃萃取溫度對(duì)萃取效率的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，所得的沉淀相變少，回收率的變化同時(shí)由沉淀相體積和萃取后目標(biāo)物濃度決定，如圖2(c)所示，在20 ℃時(shí)的回收率最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行萃取.

圖2 離子液體體積(a)，分散劑體積(b)，萃取溫度(c)，鹽濃度(d)，溶液酸度(e)，離心時(shí)間(f)，樣品體積(g)對(duì)ER的影響

2.1.6 離子強(qiáng)度的影響 在樣品溶液中加入不同量的NaCl(0～20%,W/V)，考察離子強(qiáng)度對(duì)回收率的影響.結(jié)果如圖 2(d)所示，隨著NaCl加入量的增加，回收率逐漸減小.故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不加NaCl.

2.1.7 溶液酸度的影響 溶液酸度的變化可能會(huì)改變分析物的存在形式，從而影響回收率.4種有機(jī)磷農(nóng)藥在堿性溶液中會(huì)迅速分解，故本實(shí)驗(yàn)以H3PO4調(diào)節(jié)溶液pH為2.0～7.0，考察酸度對(duì)回收率的影響.結(jié)果如圖 2(e)所示，該酸度范圍內(nèi)，萃取效率基本不變.故本實(shí)驗(yàn)不改變?nèi)芤旱乃岫?

2.1.8 萃取時(shí)間和離心時(shí)間的影響 在DLLME中，萃取時(shí)間是指混合萃取劑噴射后到離心開始的時(shí)間.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在0～10 min范圍內(nèi)，萃取效果沒有明顯變化.這是因?yàn)檩腿┧查g被霧化為極小液滴，有理想的表面積，所以萃取效率高.即分散液液微萃取快速，瞬間完成.

本實(shí)驗(yàn)中考察離心時(shí)間為2～15 min時(shí)回收率的變化.如圖2(f)所示，離心8 min時(shí)，回收率最高，這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間的離心不能使離子液體沉淀完全，而離心時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，增大離子液體在水中的溶解度，降低目標(biāo)物的回收率.故最終選擇離心8 min.

2.1.9 樣品體積的影響 樣品體積會(huì)影響回收率，為此選擇了2.0、3.0、5.0、6.0和8.0 mL的樣品溶液進(jìn)行萃取.前面優(yōu)化的萃取劑和分散劑比例為6∶70，改變樣品體積時(shí)，同時(shí)也要相應(yīng)改變萃取劑和分散劑的量，比例不變.分別用0.3、0.45、0.7、0.9和1.2 mL混合萃取劑(萃取劑與分散劑以6∶70混合)進(jìn)行萃取時(shí)，隨著樣品體積的增加，沉淀相體積也增加，萃取回收率也相應(yīng)發(fā)生了變化，如圖2(g)所示，當(dāng)樣品體積為5.0 mL時(shí)回收率最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用5.0 mL樣品溶液.

2.2 方法的評(píng)價(jià)在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)添加標(biāo)樣的蘋果樣品進(jìn)行分析，如表1所示，4種有機(jī)磷在20～2 000 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.995 5～0.999 3范圍內(nèi)，檢測(cè)限(LOD，S/N=3)為5.7～8.4 μg/kg，低于我國食品中農(nóng)藥最大殘留限量(噠嗪硫磷0.3 mg/kg、對(duì)硫磷0.01 mg/kg、倍硫磷0.05 mg/kg和伏殺硫磷2 mg/kg).以添加標(biāo)樣100 μg/kg的蘋果樣品進(jìn)行精密度考察，日內(nèi)精密度RSD(n=5)為5.4%～8.4%，日間精密度RSD(n=5)為6.1%～10.6%.富集倍數(shù)為246～273.圖3是空白蘋果樣品DLLME、空白蘋果加標(biāo)前后DLLME的HPLC圖.可見，IL-DLLME對(duì)4種有機(jī)磷具有良好的分離富集效果，可以有效提高HPLC分析的靈敏度.

圖3 空白蘋果樣品DLLME(1)、空白蘋果樣品加標(biāo)100 μg/kg(2)、加標(biāo)100 μg/kg蘋果樣品DLLME(3)HPLC圖

表1 方法的線性范圍、精密度和檢測(cè)限

2.3 實(shí)際樣品分析分別對(duì)購于超市的3種蘋果樣品進(jìn)行分析，均沒有檢出4種有機(jī)磷.為考察本方法對(duì)于實(shí)際樣品的應(yīng)用性，向蘋果樣中分別加入高、中、低3種濃度的4種有機(jī)磷，然后萃取分離分析.如表2所示，4種有機(jī)磷的平均加標(biāo)回收率為85.3%～101.1%，日內(nèi)精密度RSD為2.1%～12.6%，日間精密度RSD為4.2%～15.0%(n=5).可見，本方法回收率高、精密度好，適合于實(shí)際蘋果樣中有機(jī)磷農(nóng)藥的分析.

表2 高、中、低3種濃度的加標(biāo)回收率和精密度

2.4 方法比較將本方法與其他方法相比較，如表3所示.可見，本方法萃取快速、線性范圍寬，特別是本方法的檢測(cè)限與GC-MS的相當(dāng)，并且離子液體揮發(fā)性弱，環(huán)境友好.

表3 IL-DLLME方法與其他方法的比較(蘋果樣品)

3 結(jié)論

以離子液體[C6MIM][PF6]為萃取溶劑進(jìn)行樣品溶液的分散液液微萃取，環(huán)境友好，萃取效率高，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的有效分離富集，結(jié)合HPLC，建立了蘋果樣品中4種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分離分析方法.該方法操作簡(jiǎn)單、快速、污染小、靈敏度高、精密度好，適合用于蘋果樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的分離分析.