文/?？申?張 奇＊ 張 明 武麗輝

（1 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部；2 新疆玉昆侖天然食品工程有限公司；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所）

驢乳作為一種天然的食品資源，近年來已逐漸成為研究開發(fā)的熱點[1]。與其他奶源相比，驢乳是一種低脂肪、低膽固醇、高鈣、富硒、美容、抗衰老的天然乳品?！侗静菥V目》中對驢乳的描述為“氣味甘，冷利，無毒，熱頻飲之可治氣郁，解小兒熱毒，不生痘疹”[2]。

驢乳是接近人乳的天然乳[3]，具有抗氧化、增強人體免疫力等功能[4，5]，其營養(yǎng)價值遠優(yōu)于牛乳與羊乳。在對驢乳的前期研究中發(fā)現(xiàn)，驢乳中必需氨基酸和一些特殊生理活性氨基酸的含量均高于牛乳[6]，且經(jīng)發(fā)酵后活性氨基酸可顯著提升[7]。據(jù)報道，驢乳在抗炎等領(lǐng)域具備其特殊功效[8]。盡管維吾爾族經(jīng)典土方表明，驢乳具備調(diào)理腸道功能，但尚缺乏系統(tǒng)科學(xué)研究數(shù)據(jù)支持。

本研究以抗生素致小鼠腸道菌群失調(diào)模型為實驗動物，以驢乳為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，低聚果糖為陽性對照物，平板計數(shù)法測定腸道中腸桿菌、乳酸菌的含量和比例變化，并通過16S rDNA擴增子測序技術(shù)，測定驢乳干預(yù)后模型動物腸道菌群豐度與變化，探索驢乳調(diào)理腸道功能的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

無特定病原體（SPF）級昆明（KM）小鼠20 只，雄性，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0011]；鹽酸林可霉素（貨號：L8390）、頭孢唑啉鈉（貨號：C9680）、氨芐西林鈉（貨號：A8180），購于北京索萊寶科技有限公司；驢乳凍干粉由新疆玉昆侖天然食品工程有限公司提供；MC、VRBA培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 腸道菌群失調(diào)動物模型的建立[9]

隨機選取15 只KM小鼠，無菌條件下采集其糞便，隨后灌服抗生素溶液（以無菌生理鹽水配制的鹽酸林可霉素、頭孢唑啉鈉及氨芐西林鈉的混合液，3 種抗生素的終濃度均為20 mg/mL），0.2 mL/只，每天2 次，連續(xù)3 天。收集灌胃小鼠糞便，采用平板計數(shù)法對乳酸菌和腸桿菌進行檢測，以乳酸菌菌落數(shù)顯著降低且降低程度高于腸桿菌為模型建立成功標準。

1.3 分組及干預(yù)

將抗生素處理的15 只小鼠隨機分為模型對照自然恢復(fù)組（A組，生理鹽水）、驢乳復(fù)原乳干預(yù)組（B組，固形物含量為9.6%驢乳復(fù)原乳）、低聚果糖陽性對照組（C組，100 mg/mL低聚果糖生理鹽水溶液）3 組，每組5 只，另選未經(jīng)抗生素處理的5 只小鼠作為空白對照（D組），A、B、C組每天灌胃2次，0.2 mL/只/次，連續(xù)6 天。

1.4 糞便采集及微生物計數(shù)

于灌胃前（第0天）、灌胃3天后（第3天）和灌胃6 天后（第6天）在無菌條件下采集小鼠糞便，稀釋后分別涂布MC培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，對乳酸菌和腸桿菌進行計數(shù)分析。

1.5 微生物區(qū)系分析

為了進一步證明驢乳對小鼠腸道紊亂模型腸道微生態(tài)的改善作用，在無菌條件下收集模型自然恢復(fù)組、空白對照組、低聚果糖陽性對照組以及驢乳干預(yù)組6 天后的試驗小鼠糞便，每組隨機選擇2 只小鼠糞便作為測序樣品，委托北京博云華康基因科技有限公司對糞便中的16S擴增子進行測序，并進行微生物菌群多樣性分析。

1.6 統(tǒng)計方法

以Excel對各組小鼠腸道菌群進行分析，計算（x±s），比較各組之間差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 動物模型構(gòu)建

無菌條件下收集15 只抗生素灌胃小鼠糞便，以平板計數(shù)法檢測灌胃前后糞便中的乳酸菌和腸桿菌的變化。與空白對照組相比，經(jīng)抗生素灌胃后，小鼠腸道中乳酸菌與腸桿菌含量均顯著降低（p＜0.01），且抗生素灌胃小鼠糞便中乳酸菌含量降低更多，降低比例顯著高于腸桿菌，根據(jù)模型判斷標準，判斷模型建立成功（表1第0天）。

2.2 驢乳對乳酸菌和腸桿菌的影響

分別對第0天、第3天和第6天各組小鼠腸道菌群進行檢測。結(jié)果表明，經(jīng)驢乳復(fù)原乳和低聚果糖干預(yù)后，小鼠腸道菌群中的乳酸菌與腸桿菌含量均顯著提升，6 天后，乳酸菌基本恢復(fù)至正常水平，而模型自然恢復(fù)組乳酸菌和腸桿菌的恢復(fù)均顯著低于低聚果糖陽性對照組和驢乳干預(yù)組（表1、圖1）。

表1 腸道紊亂模型構(gòu)建及干預(yù)后腸道菌檢測[（x±s），lg CFU/g，n=5]

圖1 驢乳對小鼠腸道菌群影響

對8 只小鼠糞便進行16S擴增子測序，并分析其腸道微生物種類和豐度，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)驢乳復(fù)原乳和低聚果糖干預(yù)后，小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與空白組相當(dāng)，模型自然恢復(fù)組腸道菌群的豐度較低，說明驢乳具備顯著的改善腸道微生態(tài)功能。

進一步對微生物類型進行分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)驢乳復(fù)原乳干預(yù)的小鼠，腸道菌群中的雙歧桿菌（Bifidobacterium sp.）、乳桿菌（Lactobacillus sp.）、阿克曼菌（Akkermansia sp.）等有益菌含量均高于模型自然恢復(fù)組；與抗過敏相關(guān)的多爾氏菌屬（Dorea sp.）豐度也顯著恢復(fù)；與改善動脈粥樣硬化相關(guān)的羅斯拜瑞氏菌（Roseburia sp.）也有效恢復(fù)[10]。同時，擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、埃希氏菌屬（Escherichia sp.）等[11]條件致病菌含量降低。

圖2 腸道菌群區(qū)系分析

3 討論

本研究根據(jù)文獻報道進行致腸道紊亂的抗生素類型的選擇[9]，同時調(diào)整抗生素終濃度至20 mg/mL，灌胃KM小鼠，建立腸道菌群紊亂小鼠模型。經(jīng)檢測，灌胃小鼠糞便中腸桿菌與乳酸菌均由1×108CFU/g降至約1×104CFU/g，且乳酸菌下降更多，含量低于腸桿菌，適合于腸道微生態(tài)干預(yù)恢復(fù)研究。

由模型構(gòu)建可知，抗生素對腸道菌群影響巨大，尤其對益生菌破壞嚴重，直接影響腸道功能與機體健康。通過本研究，發(fā)現(xiàn)驢乳具有顯著的促進腸道菌群恢復(fù)功能，經(jīng)驢乳復(fù)原乳干預(yù)后的小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與正?？瞻讓φ战M相當(dāng)，且對機體有益的菌種含量恢復(fù)明顯，比例提升，即服用驢乳對改善因服用抗生素導(dǎo)致的腸道功能紊亂具有促進作用。

此外，本研究通過16S擴增子測序分析，發(fā)現(xiàn)了一些與健康有關(guān)的微生物如Roseburia sp.含量的提升。據(jù)報道，腸道中擁有Roseburia sp.的小鼠，與沒有該菌的普通小鼠相比，患動脈粥樣硬化的幾率明顯下降，且炎癥發(fā)生更少[10]。

4 小結(jié)

本研究采用抗生素灌胃構(gòu)建小鼠腸道紊亂模型，隨后以驢乳復(fù)原乳干預(yù)，采用平板計數(shù)法和16S擴增子測序法探索小鼠腸道菌群變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)驢乳復(fù)原乳干預(yù)后的模型小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與模型自然恢復(fù)組相比，乳酸菌恢復(fù)更快，益生菌比例提高，條件致病菌含量較低。由此可見，驢乳可有效改善小鼠腸道菌群，促進腸道健康。