翟少華，胡美荷，李淑嫻，劉來珍，阿爾祖古麗·阿卜力孜，王 楠，梁 天，劉海燕

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052）

細粒棘球蚴?。òx?。┦怯杉毩＜蝌始纳谌嘶騽游矬w內(nèi)而感染的一種人獸共患寄生蟲病，俗稱“蟲癌”[1]。我國是世界上包蟲病最嚴重的國家之一，新疆是高發(fā)區(qū)，在新疆家畜包蟲病感染情況調(diào)查中，肝臟棘球蚴平均感染率為50.24%；包蟲病感染率超過60%的有巴州、阿勒泰、伊犁和喀什4個地區(qū)，其中伊犁的感染率最高，達78.15%[2]。在我國分布的主要是細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲[3]。前者的幼蟲會引起細粒棘球蚴病，又稱囊型包蟲病，病例數(shù)占所有病例的90%以上；后者的幼蟲會引起多房棘球蚴病，又稱泡型包蟲病[4]。

囊型棘球蚴病對人體器官的損害中以對肝臟的損害居首位[5]。中間宿主食用被細粒棘球蚴蟲卵污染的食物或水后，在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進入血液，主要在肝和肺中發(fā)育成包囊，若包囊破裂釋放出原頭節(jié)可再次感染[6]。細粒棘球蚴在感染宿主過程中，對宿主致病的機制十分復(fù)雜，包括對宿主組織器官造成壓迫性損傷、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)以及免疫逃避等多方面問題[7]。肝包蟲包囊纖維化早已被人熟知，但其炎癥細胞的變化和形成機制尚不明確。因此，本研究旨在運用病理組織學(xué)、細胞化學(xué)和超微形態(tài)學(xué)的相關(guān)知識，將病理組織切片觀察與細胞化學(xué)染色切片觀察結(jié)合起來，共同探討細粒棘球蚴對羊肝臟的損傷性變化和肝臟包囊的形成過程，為闡釋細粒棘球蚴對機體的感染過程、肝臟纖維化以及肝細胞損傷的分子病理機制的形成提供研究基礎(chǔ)，對該病的診斷、治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 2019年8月至10月期間，收集于烏魯木齊市新市區(qū)華凌屠宰場所宰殺的阿勒泰羊中出現(xiàn)明顯包囊的完整羊肝臟，共10份。

1.2 試劑 10%福爾馬林固定液、Bouin固定液、無水乙醇、二甲苯、蘇木素染液、1%伊紅染液均購自天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；蘇木紫、猩紅、復(fù)紅、磷鉬酸、磷鎢酸、淺綠染料購自北京化工廠；冰醋酸溶液購自天津市北方化玻購銷中心。

1.3 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 選取屠宰過程中出現(xiàn)包囊的羊肝臟，沿包囊周圍與正常組織交界處剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的病變組織，置于10%中性福爾馬林固定液中固定12 h，其包囊直徑范圍在2～6 cm。共10個樣品。

1.4 感染羊肝臟組織病理組織切片制備 取已固定的肝臟包囊病變組織，用流水沖洗2 h。將樣品放入自動脫水機中按照70%乙醇（2 h）、80%乙醇（1.5 h）、90%乙醇（45 min）、95%乙醇Ⅰ（30 min）、95%乙醇Ⅱ（30 min）、100%乙醇Ⅰ（30 min）、100%乙醇Ⅱ（30 min）系列梯度逐級脫水；用二甲苯Ⅰ（二甲苯/無水乙醇1:1）、純二甲苯Ⅱ、純二甲苯Ⅲ，各透明8 min。最后用固體石蠟包埋組織、切片5 μm厚度。通過脫蠟、復(fù)水、蘇木素-伊紅染液染色各1 min，通過75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，逐級脫水各2 min。甲苯Ⅰ（二甲苯與無水乙醇1∶1）、二甲苯Ⅱ，各透明1 min，滴加中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 感染羊肝臟細胞化學(xué)染色樣品制備 石蠟切片脫蠟后置于蒸餾水中，再置入Bouin氏固定液于56℃溫箱中固定1 h，冷卻10 min；清水沖洗約10 min至切片變透明，再置入蒸餾水中清洗；Weigert氏蘇木紫溶液染10 min，清水沖洗10 min，置入蒸餾水中清洗；猩紅-酸性復(fù)紅溶液染10 min，切片置入蒸餾水中清洗；以鉬酸-磷鎢酸溶液染10～15 min做分色。檢查膠質(zhì)纖維沒有被染成紅色；使用淺綠溶液做對比染色1 min；以5%磷鎢酸溶液分色15 min；以95%乙醇、絕對酒精及二甲苯脫水及透明封片。染色結(jié)果判定：肌肉、細胞質(zhì)及角質(zhì)呈紅色；細胞核呈黑色；膠質(zhì)纖維呈綠色。

1.6 感染羊肝臟組織掃描電子顯微鏡樣品制備 從自然感染的綿羊肝臟細粒棘球蚴抽取包囊囊液和剪取包囊囊壁，分別將抽取的包囊液經(jīng)自然沉淀棄去上清液收集原頭蚴，滴加至粘貼有碳導(dǎo)電膠的掃描電鏡樣品臺上；同時將剪取的1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm包囊囊壁粘貼于掃描電鏡樣品臺碳導(dǎo)電膠上，置于場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察蟲體特征和包囊囊壁結(jié)構(gòu)特點。共7個樣品。

2 結(jié)果

2.1 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 感染羊肝臟表面可見大小不等的包囊凸出，包囊壁呈半透明狀，包囊液清亮，有的包囊體積較大向肝組織內(nèi)侵入生長，充滿囊液的棘球蚴均具有一定張力，富有彈性不易塌陷。在肝臟表面的包囊中可以透過角質(zhì)層清晰的看見顆粒狀的生發(fā)囊[8]，切開后有大量包囊液流出，包囊空虛，包囊壁呈灰白色，質(zhì)地堅韌。在凸起的包囊周圍可見散在的大范圍的壞死灶布滿整個肝臟，部分病灶相互融合形成較大范圍的不規(guī)則的融合性病灶。抽取包囊液滴在載玻片上于顯微鏡下觀察，可見大量原頭蚴，原頭蚴出現(xiàn)明顯伸縮蠕動，活力較好，多數(shù)頭節(jié)縮入蟲體內(nèi)，少數(shù)頭節(jié)伸出。原頭蚴多呈橢圓形，表面層光滑、透明。部分原頭蚴頂突和4個吸盤完全翻出，高倍鏡下頂突小鉤結(jié)構(gòu)清晰可見，體節(jié)內(nèi)鈣顆粒明顯（圖1）[9]。

圖1 感染羊肝臟包囊與包囊中原頭蚴形態(tài)Fig.1 Morphology of protocephala in liver cysts and cysts in sheep infected

2.2 細粒棘球蚴的超微形態(tài)學(xué)觀察 在場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡下，可見分離的原頭蚴呈長梭形，蟲體長度平均約120 μm，內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)、肌纖維清晰。原頭蚴上有小鉤、吸盤及微細的石灰顆粒，具有感染性。以及包囊壁上可見附著的原頭蚴蟲體。包囊壁組織結(jié)構(gòu)疏松，囊壁表面可見密集空隙結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 掃描電子顯微鏡下原頭蚴與包囊壁的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of protocephala and cyst wall under scanning electron microscope

2.3 感染羊肝臟血管病理組織學(xué)變化 通過感染綿羊的肝臟病理組織學(xué)觀察，可見肝臟呈局灶性壞死，在壞死組織內(nèi)血管管壁分解出芽，并向外側(cè)凸起延伸至炎癥區(qū)域。圍繞血管周圍有較多的纖維組織增生呈片層結(jié)構(gòu)，增生的膠原纖維自外側(cè)血管壁向周圍炎癥區(qū)域輻射擴散性生長。在出芽的血管周圍肝細胞消失，血管內(nèi)外積聚大量的嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤。嚴重病變血管壁纖維組織增生導(dǎo)致血管管腔狹窄，形態(tài)不規(guī)則（圖3）。

圖3 感染羊肝臟組織血管病理組織變化Fig.3 Pathological changes of liver blood vessels in infected sheep

2.4 感染羊肝臟組織細胞損傷與炎癥反應(yīng) 在肝臟病變區(qū)域內(nèi)可見沿血管周圍的肝細胞大范圍局灶性壞死，壞死組織融合成片，嗜伊紅性增強，以及大量的炎性細胞浸潤。在壞死組織周邊肝細胞索斷裂，細胞萎縮、形態(tài)不規(guī)則。肝細胞核消失，胞質(zhì)空泡化，壞死的炎癥區(qū)域可見纖維組織的增生（圖4）。

圖4 感染羊肝臟組織細胞損傷與炎癥反應(yīng)Fig.4 Injury of liver cells and inflammation in infected sheep

2.5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成 在病變肝組織內(nèi)增生的纖維組織沿殘存的肝細胞周圍炎癥部位生長，將炎癥區(qū)域與周圍肝組織分離，纖維化包囊逐漸形成。在纖維化包囊形成過程中炎癥細胞逐漸減少，多核巨細胞增多，包囊內(nèi)壁纖維融合形成均質(zhì)的、強嗜伊紅的纖維瘢痕組織（圖5）。

圖5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成Fig.5 Liver tissue fibrosis and cyst formation in infected sheep

2.6 細胞化學(xué)染色方法觀察感染羊肝臟纖維化形成通過Masson細胞化學(xué)染色方法對病變肝組織特殊染色可見，原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細胞壞死、組織纖維化形成均是以血管為中心所產(chǎn)生。隨著炎癥的發(fā)展，肝細胞壞死范圍增加，血管周圍纖維組織向炎癥區(qū)域伸長，所形成的纖維組織沿殘存肝細胞周圍生長，形成包囊（圖6）。

圖6 細胞化學(xué)染色觀察感染羊肝臟纖維化形成Fig.6 Cytochemical staining to observe liver fibrosis in infected sheep

3 討論

細粒棘球蚴?。òx?。┦俏覈竽恋貐^(qū)重要的人畜共患病，嚴重危害人類健康及畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。其感染途徑是由犬科動物（犬、狼）等終末宿主將細粒棘球蚴的蟲卵和孕節(jié)隨糞便排至體外，牛、羊等中間宿主吞食蟲卵后而受感染。進入消化道的六鉤蚴鉆入腸壁，在消化液的作用下囊壁溶解，原頭蚴附著在小腸壁上并開始發(fā)育。經(jīng)血流或淋巴散布到體內(nèi)各處，以肝臟、肺臟兩處最多[3]。其中Eg95基因在細粒棘球絳蟲六鉤蚴侵入小腸絨毛上皮的過程中起重要作用[10]。

細粒棘球蚴對機體的損害可以局限在寄居部位，也可以擴展到機體的其他部位，其損害方式包括：機械損傷、奪取營養(yǎng)、毒素作用及引起的免疫反應(yīng)。各種損害方式對機體的作用常導(dǎo)致細胞損害，表現(xiàn)為肝細胞的萎縮、凋亡和壞死等[11]。彭心宇等[12]在外科實踐中發(fā)現(xiàn)囊型包蟲寄生人體肝臟后致部分肝細胞“消失”的現(xiàn)象，尤以細粒棘球蚴寄生于肝左葉時此現(xiàn)象更明顯，甚至肝左葉實質(zhì)幾乎完全“消失”，實驗顯示肝纖維化與“外膜”的形成相關(guān)，包囊可能是宿主對棘球蚴的免疫而發(fā)生異物反應(yīng)形成肉芽腫樣組織并不斷纖維化增生的結(jié)果[13-14]。

目前對肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁形成機制的認識觀點略有差異。昊少廷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細粒棘球蚴寄生定位于肝臟后發(fā)育成囊腫，并不斷增大擠壓周圍肝實質(zhì)致成纖維細胞不斷增生逐漸形成膠原纖維和纖維包膜即囊，外囊是肝實質(zhì)纖維化的結(jié)果。Farrokh等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外囊是一層被擠壓的非上皮細胞化的纖維組織，與周圍肝實質(zhì)之間無解剖性分離間隙。顧樹南等[17]提出，細粒棘球蚴寄生定位于肝臟后，由于人體免疫功能及肝臟的屏蔽作用，在棘球蚴周圍的局部組織首先發(fā)生異物反應(yīng)，炎性細胞包括嗜酸性粒細胞、漿細胞及多核巨細胞浸潤滲出，由新生的成纖維細胞形成纖維結(jié)締組織包膜包裹在棘球蚴周圍形成外囊，這種纖維性的外囊與所寄生的肝臟組織無明顯的分界不能分開。外囊壁并非蟲體而是機體臟器組織發(fā)生局部纖維化所形成的屏壁。Milicevic等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肝包蟲囊腫的外囊來源于宿主器官組織內(nèi)部包裹著血管及一些小的膽管外層被擠壓萎縮的肝細胞，其與周圍肝實質(zhì)之間無明確界線，故外囊切除是非常困難的。

本研究在細粒棘球蚴感染肝臟包囊周圍的肝實質(zhì)組織呈現(xiàn)肝臟大范圍局灶性壞死，肝細胞明顯萎縮，體積顯著縮小，散在肝細胞壞死，細胞核消失，細胞質(zhì)空泡化，小血管（動脈、靜脈）管壁纖維化、玻璃樣變以及血管出芽。其原因可能是由于局部血管及膽管的纖維化引起的局部營養(yǎng)不良、淤血，原頭蚴不斷生長對肝組織的機械性壓迫造成肝細胞萎縮（壓迫性、營養(yǎng)不良性萎縮）[19]。本研究通過Masson細胞化學(xué)染色方法對病變肝組織特殊染色發(fā)現(xiàn)，原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細胞壞死，組織纖維化形成均是以血管為中心所形成。隨著炎癥的發(fā)展，肝細胞壞死范圍增加，成纖維細胞向炎癥區(qū)域伸長，所形成的纖維組織沿殘存肝細胞周圍生長而形成包囊。

通過本研究結(jié)果分析，細粒棘球蚴感染肝臟包囊形成是機體受到蟲體刺激后形成的纖維組織。隨著包囊的不斷增大，對機體的損傷越來越嚴重，病灶中心區(qū)域肝細胞大量壞死，炎癥細胞滲出聚集，形成明顯的炎癥反應(yīng)界限，成纖維細胞大量增生，炎癥反應(yīng)外周肝組織纖維化形成。包囊組織發(fā)生液化性壞死，包囊液形成，包囊開始發(fā)育。同時發(fā)現(xiàn)肝臟組織局灶性壞死，肝細胞萎縮、壞死、纖維化囊壁的形成都是圍繞在血管周圍，說明血管是原頭蚴進入肝臟的主要途徑而不是簡單的附著在肝臟表面。上述研究尚屬初步，血管病理及纖維化囊壁的形成是其生長過程中一種較普遍的病理現(xiàn)象，是與肝蟲病診斷、治療、愈后密切相關(guān)的一個病理學(xué)表現(xiàn)[20]。細粒棘球蚴對肝臟的致病機制還需通過建造小鼠模型進一步探索發(fā)現(xiàn)血管病理，纖維囊壁形成的時間節(jié)點，組織局灶壞死過程以及通過分子病理分析肝臟纖維化形成相關(guān)因子的作用等。

本研究通過對感染原頭蚴綿羊肝臟包囊形成和肝細胞壞死的病理組織學(xué)、細胞化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)原頭蚴感染后病變產(chǎn)生于感染組織的血管周圍，血管壁纖維組織分解、管壁出芽，分解并增生的纖維組織伸向周圍炎癥區(qū)域內(nèi)，血管管腔及炎區(qū)大量嗜酸性粒細胞浸潤，肝細胞萎縮、變性、壞死，增生的膠原纖維沿殘存的肝細胞周圍圍繞病變組織包囊壁形成。