翟 頎，翟少倫，呂殿紅，溫肖會(huì)，吳國景，霍 瑋，涂 杜，魏文康，賈春玲，周秀蓉

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州510640）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種無芽孢、無莢膜的革蘭氏陰性條件致病菌[1]，在自然界中分布廣泛，可存在于泥土、糞便、污水中，能引起人細(xì)菌性食物中毒，可誘發(fā)尿道炎、尿道結(jié)石、腎結(jié)石、菌血癥等多種疾病，嚴(yán)重的可致死，對其引起的疫病的防控具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[2-4]。

竹鼠屬于嚙齒目竹鼠科竹鼠屬，體大肉多，營養(yǎng)豐富，味極鮮美，皮毛細(xì)軟，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。在華南地區(qū)，規(guī)?；B(yǎng)殖竹鼠已經(jīng)逐步成為經(jīng)濟(jì)效益顯著的產(chǎn)業(yè)，但竹鼠在規(guī)模養(yǎng)殖后，其生活習(xí)性和機(jī)體環(huán)境等方面發(fā)生變化，容易引發(fā)許多疾病[6-7]。竹鼠的細(xì)菌性疾病較為常見，已有大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、弗氏檸檬酸桿菌等病原菌感染竹鼠的報(bào)道[7-10]。本研究從廣東某竹鼠人工養(yǎng)殖場的竹鼠血液和肺臟中分離到1株革蘭氏陰性菌，經(jīng)16S rRNA核苷酸序列比對鑒定為奇異變形桿菌，對分離株的生化特性、藥物敏感性和16S rRNA遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，本研究結(jié)果為華南地區(qū)竹鼠疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018年11月，廣東某竹鼠養(yǎng)殖場發(fā)生竹鼠陸續(xù)死亡的疫病，該養(yǎng)殖場存欄竹鼠400只以上，發(fā)病竹鼠多為4～5月齡，病鼠被毛粗亂，形體消瘦，有腹瀉、嘔吐癥狀，現(xiàn)場剖檢后可見肺部有壞死點(diǎn)，肝臟和腸道有出血，為查明病因，現(xiàn)場采集竹鼠血液和肺臟樣品各1份。

1.2 主要試劑 TSB培養(yǎng)基、M-H瓊脂、單盒生化鑒定管、革蘭氏染色液和血瓊脂平板購自廣州環(huán)凱微生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker和瓊脂糖購自天根生化有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離 將采集的病料在無菌條件下分別劃線接種血液瓊脂平板，經(jīng)37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取形態(tài)特征一致的菌落重新劃線接種于血液瓊脂平板進(jìn)行純化，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并將菌種接種于TSB培養(yǎng)液中備用。

1.4 生化試驗(yàn) 將純化的菌株分別接種于含有下列培養(yǎng)基的生化鑒定管中：尿素、木糖、山梨醇、棉子糖、側(cè)金盞花醇、三糖鐵、硫化氫、鳥氨酸、賴氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、西蒙氏檸檬酸鹽。接種后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，參考廣州環(huán)凱微生物有限公司生化鑒定管使用說明書初步判定細(xì)菌菌屬。

1.5 分離菌株16S rRNA的擴(kuò)增及序列分析 提取菌株的基因組DNA，參考文獻(xiàn)合成16S rRNA基因通用引物，F(xiàn): 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，R: 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，2× TaqMan Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測序后進(jìn)行序列分析。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用Kirly-Baue紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，無菌吸取培養(yǎng)過夜的新鮮菌懸液并將其均勻涂布于M-H瓊脂平板上。用無菌鑷子取藥敏片輕輕貼附于平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察并測量抑菌圈直徑，判定分離菌株對藥物的敏感性。藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織公布的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色 發(fā)病竹鼠血液和組織接種血液瓊脂平板37℃培養(yǎng)過夜后，均出現(xiàn)1種無色透明、不溶血、具有腐敗臭味的菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后，可見該菌形狀不一，為桿狀、球狀和球桿狀的革蘭氏陰性菌（圖1），基本符合變形桿菌的培養(yǎng)特性。

圖1 分離菌的革蘭氏染色結(jié)果（100×）Fig.1 Gram staining result of the isolate (100×)

2.2 生化試驗(yàn) 山梨醇、木糖、三糖鐵、尿素、西蒙氏檸檬酸鹽和硫化氫等生化結(jié)果為陽性，棉子糖、側(cè)金盞花醇、賴氨酸和蛋白胨水結(jié)果為陰性，具體結(jié)果見表1。結(jié)果表明，分離菌株的生化特性與奇異變形桿菌的基本一致。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果Table 1 The results of biochemical identification for the isolate

2.3 16S rRNA基因序列分析 擴(kuò)增的16 s rRNA PCR產(chǎn)物約為1450 bp（圖2）。其序列經(jīng)Blastn比對顯示，與我國云南奇異變形桿菌100%同源株（GenBank登錄號(hào)：KC456539）的序列相似性為100%。因此，鑒定該分離菌為奇異變形桿菌命名為GD/ZS-01株。與NCBI中部分國內(nèi)外的奇異變形桿菌16S rRNA進(jìn)行ClustalW多重序列比對分析表明，GD/ZS-01株與其他菌株的 16s rRNA相似性均在99%以上（圖1）。用Mega X的Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示，GD/ZS-01株與奇異變形桿菌在同一分支上，而與大腸桿菌（Escherichia coli）H1株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。奇異變形桿菌為條件致病菌，當(dāng)環(huán)境改變導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫抵抗力下降時(shí)，尤其是發(fā)生其他疾病時(shí)，易發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染。因此，在竹鼠養(yǎng)殖過程中要搞好衛(wèi)生防疫工作，發(fā)現(xiàn)異?；疾≈袷髴?yīng)及時(shí)隔離處理，防止疾病傳播。奇異變形桿菌的血清型多達(dá)100個(gè)[11]，免疫預(yù)防的難度較大，當(dāng)前主要依靠抗菌藥物進(jìn)行治療，因此亟待加強(qiáng)對該病原菌感染動(dòng)物引起的臨床癥狀、防治技術(shù)的研究。

圖2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA of the isolate

圖3 奇異變形桿菌16S rRNA基因序列比對結(jié)果Fig.3 The alignment results based on 16S rRNA sequence of Proteus mirabilis

圖4 奇異變形桿菌16S rRNA核酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA nucleotide sequences of Proteus mirabilis

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 本試驗(yàn)選用了27種常用抗菌藥對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該菌對頭孢哌酮、丁胺卡那和左氧氟沙星高度敏感，對頭孢噻肟、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、多粘菌素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素、桿菌肽、鏈霉素9種藥物中度敏感，對頭孢他啶、萬古霉素、紅霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、恩諾沙星、四環(huán)素、氯霉素9種藥物表現(xiàn)耐藥。該結(jié)果提示奇異變形桿菌GD/ZS-01株是一株多重耐藥菌株，這可能與飼養(yǎng)過程中濫用抗生素有關(guān)，建議該養(yǎng)殖場可在獸醫(yī)的指導(dǎo)下選用高度敏感的藥物進(jìn)行有效治療，同時(shí)在后續(xù)養(yǎng)殖過程中應(yīng)高度警惕盲目用藥、濫用抗生素的問題。