黃忠榮，張風(fēng)榮，費(fèi)婭緋，林穎崢，張 強(qiáng)，李 健，王 艷

（1.上海海關(guān)，上海 200135；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261061；3.上海海關(guān)動植物與食品檢疫局檢驗(yàn)技術(shù)中心，上海 200135）

實(shí)驗(yàn)動物是生物醫(yī)藥研究的基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于藥物評價(jià)和毒性實(shí)驗(yàn)，微生物、寄生蟲和腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)動物是替代人類去獲取與生命健康息息相關(guān)的各種科學(xué)實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)品質(zhì)量檢定、環(huán)境檢測等數(shù)據(jù)的重要工具，被稱為“活的試劑”、“活的儀器”，為人類健康研究和生命科學(xué)發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。人獸共患病由脊椎動物和人類的共同病原體引起[2]，曾給人類造成了巨大的危害。布魯菌病（Brucellosis）是一種由布魯菌引起的人獸共患傳染病，患病牛、羊、豬、犬等是人類布魯菌病的主要傳染源[3]；沙門菌（Salmonella）是一類可以引起沙門菌病的人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界中[4]；弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，T. gondii）引起的嚴(yán)重的人獸共患原蟲病，可以感染包括人在內(nèi)的大部分溫血脊椎動物，是一種高度流行的人獸共患病[5-6]。已有研究獲得弓形蟲可溶性GRA1蛋白，對弓形蟲的早期診斷具有一定意義[7]。目前對這3種實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量相關(guān)病原的快速高通量檢測方法的研究與建立還處于空白，高通量檢測方法[8]的建立有助于預(yù)防實(shí)驗(yàn)動物人獸共患病，降低人獸共患病原菌對實(shí)驗(yàn)人員的安全威脅。

本研究利用液相芯片高通量的特點(diǎn)，針對以上3種目標(biāo)病原體基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，建立了可同時(shí)檢測布魯菌、沙門菌和弓形蟲的液相芯片檢測方法，該方法的建立對公共安全衛(wèi)生保障和進(jìn)出境實(shí)驗(yàn)動物檢疫具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 陽性對照 含有沙門菌、布魯菌和弓形蟲目的基因的質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所友情饋贈；含有巴氏通體、彎曲桿菌、狂犬病病毒目的基因的質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器 藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-phycoerythrin，SA-PE）購自美國Invitrogen公司；熒光編碼微球Bio-PlexTM200購自美國Bio-Rad公司。

1.3 探針及引物 根據(jù)GenBank登錄的沙門菌、布魯菌和弓形蟲基因序列，應(yīng)用分析軟件選取最保守的序列（25個(gè)核苷酸左右）設(shè)計(jì)成探針，在5'端標(biāo)記-NH2，并依據(jù)探針設(shè)計(jì)引物。BruF：5'-biotin-GGCTCGGTTGCCAATATCAA-3'，BruR：5'-CG CTTGCCTTTCAGGTCTG-3'，BruP：5'-NH2-TTT TTTTTTTGACTCCAGAGCGCCCG3'；SalF：5'-A ACGTGTTTCCGTGCGTAAT-3'，SalR：5'-biotin-CCATCAAATTAGCGGAGGC-3'，SalP：5'-NH2-TTTTTTTTTTATGGAAGCGCTCGCAT-3'；ToxF：5'- biotin-CCCTCTGCTGGCGAAAAGT-3'，ToxR：5'-biotin-CCCTCTGCTGGCGAAAAGT-3'，ToxP：5'-NH2-TTTTTTTTTTGAATACACCAAAGTTGCAC AG-3'。引物、探針由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 微球探針的交聯(lián) 在EP管中加入100 μL相應(yīng)的微球，5000×g離心10 min后棄上清液，并用滅菌ddH2O洗滌2次；用100 μL 10 mmol/L pH6.0的MES（2-[嗎啉]乙基磺酸，2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid hydrate）重新懸浮后，加入20 μmol/L的探針3 μL，振蕩混勻后加入15%EDC（1-乙基-3（3-二甲胺基丙基），1-ethyl-3[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride），避光條件下，37℃恒溫孵育30 min；離心后棄去上清液，用0.1% SDS洗滌2次后，加入50 μL TE緩沖液（pH8.0）懸浮，即完成微球探針的交聯(lián)。

1.5 雜交捕獲檢測 反應(yīng)體系：取PCR產(chǎn)物5 μL，加入充分混勻后的微球溶液25 μL，4℃條件下孵育3 min，50℃條件下孵育30 min；加入0.2 μg/μL的 SAPE 70 μL，50℃條件下孵育20 min，上機(jī)讀取平均熒光強(qiáng)度（median fluorescent intensity，MFI）值。

1.6 探針特異性的檢測 將沙門菌、布魯菌和弓形蟲3種微球混合后進(jìn)行雜交捕獲檢測，以確定3種探針的特異性。

1.7 液相芯片檢測體系閾值 將20份沙門菌、布魯菌、弓形蟲陰性樣品抽提DNA并進(jìn)行PCR，用于液相芯片檢測，計(jì)算變異系數(shù)，確定本研究建立的液相芯片檢測方法的cut-off值。

1.8 液相芯片檢測體系特異性 用建立的液相芯片檢測體系對含有沙門菌、布魯菌、弓形蟲、狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌目的基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行雜交檢測，確定建立的液相芯片檢測體系的特異性。

1.9 液相芯片檢測體系靈敏度 將含有布魯菌、沙門菌、弓形蟲目的基因的質(zhì)粒分別作5倍（100拷貝/反應(yīng)）、10倍（50拷貝/反應(yīng)）、50倍（10拷貝/反應(yīng)）稀釋，驗(yàn)證所建立的液相芯片檢測方法的靈敏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針特異性的檢測 3種微球混合后，分別能特異性地檢測出布魯菌（MFI 3183）、沙門菌（MFI 1221）、弓形蟲（MFI 6025）的目的基因片段，而檢測狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌3種病原體的目的基因的MFI值極低，均為陰性，表明設(shè)計(jì)的探針具有良好的特異性。

2.2 液相芯片檢測體系閾值的確定 將20份均未被沙門菌、布魯菌、弓形蟲感染的陰性樣品經(jīng)DNA抽提后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物用于液相芯片檢測。根據(jù)測得的MFI的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差來計(jì)算閾值（表1），其計(jì)算公式：85.4+3×12.56=123.08。

表1 液相芯片檢測體系閾值Table 1 MFI results of liquichip technique

2.3 液相芯片檢測體系的特異性 采用單對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物篩選出特異性較好的探針后，對建立的液相芯片檢測方法進(jìn)行特異性檢測（表2）?；旌系?種探針可針對布魯菌、沙門菌和弓形蟲的目的基因進(jìn)行有效地識別捕獲，且對其他狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌3種病原體的目的基因無明顯的信號（其MFI值均低于閾值123.08），表明建立的液相芯片檢測方法具有較好的特異性。

表2 液相芯片檢測體系特異性結(jié)果Table 2 The specificity test results of liquichip technique

2.4 液相芯片檢測體系靈敏度 利用建立的液相芯片檢測方法對濃度系列稀釋的DNA模板進(jìn)行檢測（表3）。結(jié)果顯示，所建立的液相芯片檢測方法靈敏度為50拷貝/反應(yīng)。本研究利用液相芯片高通量的特點(diǎn)，將PCR方法與液相芯片相結(jié)合，針對布魯菌、沙門菌、弓形蟲3種病原體的目的基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，建立了一種實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)病原體快速高通量檢測方法，同一反應(yīng)管中可同時(shí)檢測出3種重要的人獸共患病病原，免去了普通PCR過程中需要進(jìn)行凝膠電泳的繁瑣步驟，提高了檢測效率，對公共安全衛(wèi)生、進(jìn)出境實(shí)驗(yàn)動物檢疫具有重要的指導(dǎo)意義。于博等[9]建立了布魯菌RPA-LFD檢測方法，其靈敏度可達(dá)10拷貝/μL；袁淑萍[10]等建立了豬弓形蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其靈敏度可達(dá)10拷貝/μL；郭澍強(qiáng)等[11]建立了沙門菌LAMP快速檢測方法，其靈敏度可達(dá)10 CFU/mL；本研究所建立的液相芯片檢測方法的靈敏度為50拷貝/反應(yīng)，其靈敏度稍低于其他單個(gè)檢測方法，同時(shí)由于該方法只涉及了3種病原體，其高通量的優(yōu)點(diǎn)并未充分體現(xiàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以針對實(shí)驗(yàn)動物其他人畜共患病病原體設(shè)計(jì)特異性的探針，以期可以同時(shí)檢測更多的病原體。

表3 液相芯片檢測體系靈敏度結(jié)果Table 3 The sensitivity test results of liquichip technique