林蕓秀 江明珠 閆 培 謝詹雄 林淑萍 葉浩峰 湯 璇 魏玉珍 楊信志△

（福建醫(yī)科大學(xué)，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2 臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350122）

細(xì)胞的聚團(tuán)培養(yǎng)首先被Reynold 和Weiss[1]用于分離干細(xì)胞，隨后被應(yīng)用于許多細(xì)胞的研究，如神經(jīng)干細(xì)胞[1-2]、角膜干細(xì)胞[3-4]、腫瘤干細(xì)胞[5]等。所形成的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，無(wú)論是對(duì)其膜蛋白還是對(duì)其細(xì)胞核進(jìn)行的免疫熒光染色來(lái)做定性的分析時(shí)，首先都需要對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行石蠟包埋切片[6]。這種石蠟切片技術(shù)要經(jīng)過(guò)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等一系列復(fù)雜而耗時(shí)的程序，且這種較強(qiáng)烈的處理方法（有機(jī)試劑及較高的溫度）還會(huì)對(duì)細(xì)胞中的抗原有著一定程度的損害。雖然Weiswald 等[7]用非切片法對(duì)腫瘤細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行了熒光免疫標(biāo)記，利用多聚甲醛和Triton X-100 混合物同時(shí)固定和滲透細(xì)胞團(tuán)塊，然后對(duì)所固定的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行脫水、抗體標(biāo)記、制片、激光共聚焦觀察，但操作方法仍顯復(fù)雜。本研究改良了非切片法對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的熒光定性檢測(cè)方法，采用免疫熒光染色和非免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，利用冰甲醇直接固定細(xì)胞團(tuán)塊樣本，對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記后，直接置于玻璃底培養(yǎng)皿上觀察，這種改良的方法省卻了脫水和制片的過(guò)程，使操作更加簡(jiǎn)單、快速。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

選用清潔級(jí)健康6～8周齡美國(guó)癌癥研究所選育的雌性小鼠30只，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）試劑盒（Ribobio，廣州）；小鼠抗上皮特異性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體（Servicebio，武漢）；山羊抗小鼠IgG（Abcam，英國(guó)）；水凝膠（Mebiol Gel，日本）；PrEGM BulletKit（Lonza，美國(guó)）。

1.2 輸卵管全細(xì)胞的準(zhǔn)備

6～8周齡雌鼠斷頸處死后取輸卵管，去掉周?chē)闹窘M織及系膜，用眼科鑷子撕碎，放入含有0.25 mg/mL 的膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅱ的杜氏PBS（DPBS）中，37℃消化20 min，然后輕輕吹打使細(xì)胞分散，1 000 r/min 離心5 min加入5 mL 含10% FBS 的PrEGM 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后通過(guò)直徑為40 μm 的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾掉沒(méi)有消化的組織團(tuán)塊，分散的細(xì)胞懸浮液離心（1 000 r/min，5 min）后用含10% FBS 的PrEGM 培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為1×107/mL 的溶液備用。

1.3 水凝膠的準(zhǔn)備

粉末水凝膠用商家建議的PrEGM 量稀釋?zhuān)?℃環(huán)境中緩慢地?fù)u動(dòng)過(guò)夜，然后在4℃下靜置至少3 d備用。

1.4 細(xì)胞克隆團(tuán)的培養(yǎng)和回收

取0.1 mL 上述備好的細(xì)胞懸浮液與0.9 mL 水凝膠溶液反復(fù)輕輕吹打混勻，然后取0.20～0.25 mL 的細(xì)胞-水凝膠混合溶液放入24 孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)箱中靜置5 min 使凝膠凝固。然后加入1 mL 含10%FBS 的PrEGM BulletKit 在5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。

培養(yǎng)6 d，把24孔培養(yǎng)板放置到冰上靜置5 min，使凝膠溶解。然后將凝膠溶液收集到15 mL的離心管中，1 000 r/min 離心3 min，用冷PBS 洗2次，每次1 000 r/min，3 min，收集細(xì)胞團(tuán)備用。

1.5 EdU 插入培養(yǎng)

上述三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的細(xì)胞克隆團(tuán)培養(yǎng)至6 d，棄掉培養(yǎng)液，然后加入含10%FBS，50 μmol/L EdU 的PrEGM BulletKit 1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，使EdU 插入到合成的DNA 中，然后回收細(xì)胞團(tuán)備用。

1.6 Apollo 染色檢測(cè)EdU 標(biāo)記的細(xì)胞核

EdU 插入培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)用-20℃甲醇固定過(guò)夜。室溫環(huán)境中加入Apollo 反應(yīng)液并輕輕搖晃6 h，使其與插入的EdU 反應(yīng)均勻，然后用Hoechst33342染細(xì)胞核，避光保存待觀察。

1.7 免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的膜蛋白EpCAM

上述步驟（1.4）獲得的細(xì)胞克隆團(tuán)用-20℃的甲醇固定5 h，然后用含有0.2%Triton X-100 的冷PBS（PBST）洗2次，將細(xì)胞克隆團(tuán)放入含10%山羊血清的PBST 中封閉孵育3 h，加入含anti-EpCAM 的PBST溶液（1∶200），4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育。用含1%山羊血清的PBST 清洗2次，每次5 min，1 000 r/min 離心5 min。細(xì)胞團(tuán)沉淀用含山羊抗小鼠IgG 二抗的PBST（1∶400）室溫培養(yǎng)2 h，PI 復(fù)染細(xì)胞核后將樣本避光保存。

1.8 激光共聚焦顯微觀察熒光標(biāo)記情況

所有避光保存的樣本運(yùn)到激光共聚焦顯微觀察室，觀察之前，將50μL 的樣本懸浮液放入玻璃底培養(yǎng)皿中，置于共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上靜置1～2 min，觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 克隆細(xì)胞團(tuán)在三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中的形成

利用單個(gè)分散的輸卵管全細(xì)胞在凝膠中培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)第0天，可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞均勻分散在凝膠中（圖1A，見(jiàn)封三）；由于凝膠可以阻止細(xì)胞遷移，因此，凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)可防止細(xì)胞聚集現(xiàn)象。培養(yǎng)至第3 天時(shí)，具有增殖能力的細(xì)胞在原位分裂增殖，并形成了由單個(gè)細(xì)胞增殖而來(lái)的較小的細(xì)胞克隆團(tuán)（圖1B，見(jiàn)封三），這些小細(xì)胞克隆團(tuán)在繼續(xù)培養(yǎng)到第6 天時(shí)逐漸長(zhǎng)大，形成圓球形細(xì)胞克隆團(tuán)塊（圖1C，見(jiàn)封三）以及培養(yǎng)6 d凝膠解聚回收的細(xì)胞團(tuán)（圖1D，見(jiàn)封三）。

2.2 非免疫熒光EdU 染色對(duì)細(xì)胞團(tuán)S 期細(xì)胞的標(biāo)記

EdU 的標(biāo)記結(jié)果顯示細(xì)胞團(tuán)中的很多細(xì)胞被標(biāo)記成陽(yáng)性（圖2A～C，見(jiàn)封三），熒光分布在細(xì)胞核中，說(shuō)明細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞有著明顯的分裂增殖活動(dòng)，表明EdU 可以通過(guò)非切片法被用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的增殖情況（圖2D～F，見(jiàn)封三）。

2.3 對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞表面抗原的熒光標(biāo)記

因?yàn)檩斅压軆?nèi)膜干細(xì)胞明確表達(dá)EpCAM，因此以EpCAM 作為細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的表面抗原，從而對(duì)其進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記來(lái)驗(yàn)證非切片法熒光染色的適用情況。結(jié)果顯示，凝膠培養(yǎng)形成的細(xì)胞團(tuán)都有表達(dá)EpCAM，而且染色也比較均勻、強(qiáng)烈（圖3A～C，見(jiàn)封三），陰性對(duì)照（圖3D～F，見(jiàn)封三）為一抗空白組。說(shuō)明非切片的免疫熒光染色方法可以用于定性鑒定細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的膜蛋白的表達(dá)。

3 討論

三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)，越來(lái)越多地被用來(lái)培養(yǎng)和擴(kuò)增細(xì)胞[8-10]。由于凝膠的特點(diǎn)，細(xì)胞在凝膠培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)發(fā)生遷移而聚集[11]。因此培養(yǎng)得到的細(xì)胞團(tuán)是由單個(gè)細(xì)胞增殖而形成，并且這些細(xì)胞有著較強(qiáng)的分裂增殖能力。而輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞在三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中可以形成細(xì)胞團(tuán)，這種強(qiáng)烈的增殖能力也被認(rèn)為是干細(xì)胞的自我更新能力[5，12]。

對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的定性分析，傳統(tǒng)的方法是切片法。雖然有研究用非切片技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行免疫熒光觀察，但其程序略顯復(fù)雜，在對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行固定后，還要對(duì)其進(jìn)行逐步脫水，在對(duì)細(xì)胞團(tuán)染色之后，要將樣本吸附至玻片，吸掉多余的液體，再用90%的甘油重新懸浮，再置于載玻片和蓋玻片之間由雙面膠圍成的間隙內(nèi)，蓋上蓋玻片后用膠封片觀察[7，13]。本實(shí)驗(yàn)用冰甲醇對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行固定，不需要脫水的步驟，在對(duì)三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中所形成的干細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行非免疫和免疫熒光染色，然后將樣本懸浮液直接置于NEST 玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行觀察，得到了良好的觀察效果。

對(duì)形成細(xì)胞團(tuán)的干細(xì)胞自我更新能力的鑒定，傳統(tǒng)的方法是用BrdU 插入復(fù)制期的染色質(zhì)中，然后用抗BrdU 的抗體來(lái)標(biāo)記[6，14]。這種方法需要在處理的過(guò)程中對(duì)樣本石蠟包埋、切片、脫蠟、DNA 變性等一系列復(fù)雜的處理。而EdU 是近10年來(lái)新出現(xiàn)的鑒定細(xì)胞增殖能力的技術(shù)，EdU 可以代替DNA 中的胸腺嘧啶（T），EdU 可以插入到復(fù)制DNA 鏈中，在Cu+催化下與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化合物探針?lè)磻?yīng)，快速生成穩(wěn)定的三唑環(huán)，并發(fā)出熒光。與BrdU 檢測(cè)方法相比，EdU 檢測(cè)方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確。EdU 與T 非常相似，而且EdU 染料只有BrdU 抗體的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA 變性（酸解、熱解、酶解等）處理，可有效避免樣品損傷，而且無(wú)需抗原抗體反應(yīng)，能在細(xì)胞和組織水平更快速便捷地反映DNA 復(fù)制活性[15-16]。因此，用EdU 標(biāo)記干細(xì)胞，可以說(shuō)明干細(xì)胞的自我更新能力。一般而言，細(xì)胞的EdU 標(biāo)記都是對(duì)貼壁的單層細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記觀察或細(xì)胞懸浮液標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)用EdU 對(duì)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，并且在細(xì)胞團(tuán)內(nèi)直接觀察，并得到了良好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞團(tuán)的染色結(jié)果表明，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的部分細(xì)胞的細(xì)胞核為EdU 陽(yáng)性，揭示細(xì)胞團(tuán)的部分細(xì)胞具有自我更新的能力，因此本研究直接對(duì)細(xì)胞團(tuán)的染色方法可以用來(lái)鑒定細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，并不是全部的細(xì)胞都呈EdU 陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞在標(biāo)記期間并不是都處于DNA 復(fù)制期，或者有些干細(xì)胞在增殖的過(guò)程中也逐漸分化，從而失去了自我更新的能力。本研究利用改良的非切片方法第一次對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行EdU 標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明這種染色方法對(duì)EdU 標(biāo)記的觀察是可行的。

本實(shí)驗(yàn)所使用的三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的細(xì)胞克隆團(tuán)，被證明是由單個(gè)輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞增殖而成[17]。這些細(xì)胞都明確表達(dá)輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞的一個(gè)膜蛋白標(biāo)記物分子EpCAM。因此，選用非石蠟切片方法標(biāo)記這些細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞膜上的EpCAM，檢測(cè)這種改良的非切片法是否適合膜蛋白的免疫熒光染色。

對(duì)細(xì)胞團(tuán)的免疫熒光分析，傳統(tǒng)的方法也是對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等一系列較強(qiáng)的物理和化學(xué)的處理，這種處理方法會(huì)在一定程度上破壞細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)，從而使染色結(jié)果在一定程度上失真。用非切片法可以對(duì)細(xì)胞團(tuán)直接染色，避免了對(duì)細(xì)胞樣本的強(qiáng)處理，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及組織結(jié)構(gòu)在最大限度上得以保留，膜蛋白等抗原物質(zhì)也受到了最大限度的保護(hù)，因此，這種方法的染色會(huì)最大限度反映活細(xì)胞的真實(shí)結(jié)構(gòu)。另一方面，這種染色方法還可以用激光共聚焦顯微鏡來(lái)掃描細(xì)胞團(tuán)各個(gè)層次的結(jié)構(gòu)，從而更加全面地掌握細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的分布情況及性質(zhì)。利用改良的非切片方法對(duì)細(xì)胞膜蛋白EpCAM 進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，EpCAM 在這些細(xì)胞膜上都有強(qiáng)表達(dá)，并且可以觀察到EpCAM均勻地分布在細(xì)胞膜上，說(shuō)明這種改良的非石蠟包埋的免疫熒光染色方法可以被用來(lái)對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行免疫熒光分析。由于細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞高度密集相互影響，普通熒光顯微鏡不能很好地觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而激光共聚焦顯微鏡卻能很好地分辨出細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[18]。

綜上所述，通過(guò)對(duì)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核化學(xué)反應(yīng)法染色以及對(duì)細(xì)胞膜的非切片的免疫熒光染色法的檢測(cè)，證明了改良后的非切片法可以利用激光共聚焦顯微鏡很好地用于對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊細(xì)胞的定性分析。

圖版說(shuō)明（圖見(jiàn)封三）

圖1 輸卵管細(xì)胞在三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中形成了細(xì)胞團(tuán)，標(biāo)尺=50 μm。分散的輸卵管細(xì)胞在凝膠中培養(yǎng)第0、3 和6 天的情況（A～C）以及第6 天低溫解聚凝膠后收集到的細(xì)胞團(tuán)（D）.

圖2 EdU標(biāo)記輸卵管內(nèi)膜干細(xì)胞團(tuán)，標(biāo)尺=25 μm。EdU 插入到細(xì)胞團(tuán)中處于S 期的細(xì)胞核內(nèi)（A～C）和無(wú)EdU 插入的陰性對(duì)照（D～F）.

圖3 非切片處理法對(duì)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm。用小鼠EpCAM 抗體對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行了免疫熒光染色，細(xì)胞團(tuán)被均勻地染色并發(fā)出清晰的熒光（A～C），陰性對(duì)照（D～F）為一抗空白組.