扶玉珍 姚方輝

（1 湖北醫(yī)藥學院組織學與胚胎學教研室，2 十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院）普外科，十堰 442000）

糖尿病性耳聾是一種以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性耳聾，長期高血糖及糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）的不斷聚積導致的氧化應激可激活多種凋亡信號通路造成耳蝸毛細胞的不可逆性損害[1]。雷公藤甲素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。雷公藤甲素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞具有保護作用[5]，但是雷公藤甲素對糖尿病耳蝸毛細胞的影響研究較少。本研究建立了2型糖尿病小鼠模型，觀察雷公藤甲素對2型糖尿病小鼠耳蝸毛細胞的保護作用并探討了其作用機制，旨在為糖尿病耳蝸病變的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

雷公藤甲素（購于成都普思生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）；小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海朗頓有限公司）；琥珀酸鈉（武漢博士德生物工程有限公司）；氯化硝基四氮唑藍NBT（美國Amresco 公司）；磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphoextracellular signal-regulated kinase，p-ERK）、細胞外調(diào)節(jié)p-ERK 的總蛋白（ERK）、E2 核因子相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf2）、硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）及p-JNK、cleaved-caspase-3 抗體（美國Santa Cruz 公司）；

1.2 2型糖尿病小鼠模型建立及給藥方法

SPF級Balb/c雄性小鼠，4～5周，體質(zhì)量22～25 g，（湖北醫(yī)藥學院實驗動物研究中心）。隨機分為正常組（Control）、糖尿病組（T2DM）和雷公藤甲素組（T2DM+TPL），每組10只。3組均適應性喂養(yǎng)1 周。1 周后對照組喂以基礎飼料，2型糖尿病模型組喂以高脂高糖飼料（48.50%基礎飼料，20.00%蔗糖，20.00%蛋黃粉，10.00%熟豬油，1.00%膽固醇，0.50%脫氧膽酸鈉）[6]。各組喂養(yǎng)相應飼料4 周后均禁食不禁水12 h，2型糖尿病模型組1%鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg 腹腔注射1次，1 周后相同條件下2型糖尿病模型組第2次腹腔注射STZ 40 mg/kg。對照組相對應腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于第2次STZ 注射后每隔5 d 小鼠尾靜脈取血測空腹血糖值（FBG），監(jiān)測血糖及體質(zhì)量。并采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定小鼠胰島素（FINS）水平，按小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明操作。計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。以小鼠尾靜脈空腹血糖值大于11.1 mmol/L 及出現(xiàn)胰島素抵抗為建模成功[7]。2型糖尿病動物模型建立成功后1 周，雷公藤甲素組小鼠給予雷公藤甲素 0.1 mg/kg 灌胃，連續(xù)治療6周，正常組和糖尿病組小鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃1次。

1.2 耳蝸基底膜琥珀酸脫氨酶（SDH）染色及耳蝸毛細胞計數(shù)

4%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后4～5 min，在解剖顯微鏡下用解剖鑷迅速開顱，打開聽泡取出耳蝸，用細針尖挑破圓窗膜及摘除鐙骨，開放前庭窗和圓窗。從蝸頂鉆一小孔，將NBT 工作液（0.05 mol/L 琥珀酸鈉溶液，0.05 mol/L 磷酸緩沖液，0.1%NBT 按1：1：2 配制）從圓窗內(nèi)緩慢灌入耳蝸內(nèi)，可見工作液從蝸頂?shù)男】變?nèi)流出，即為耳蝸蝸管內(nèi)灌注成功，繼之將耳蝸置于該NBT工作液中37℃孵育1 h；將耳蝸置于10%福爾馬林內(nèi)室溫固定2 d，再將耳蝸放于7% EDTA 二鈉脫鈣液中（pH6.9），室溫下直到耳蝸軟化。體視顯微鏡下分離耳蝸基底膜，平鋪基底膜于滴有甘油的載玻片上，覆蓋蓋玻片封片。最后，將基底膜鋪片置于光學顯微鏡下（放大200倍）以相等的距離200 μm 從耳蝸頂回至底回取25個點進行活外（OHC）、活內(nèi)（IHC）毛細胞計數(shù)（n=3），統(tǒng)計分析。

1.3 小鼠耳蝸中氧化應激相關信號通路、抗氧化蛋白分子及凋亡分子的蛋白表達檢測

分離耳蝸組織，加入裂解液提取總蛋白，進行蛋白濃度檢測后，進行SDS-PAGE 蛋白電泳分離蛋白，轉膜，PBS 洗滌3次，加入脫脂牛奶封閉1 h，然后加入ERK、p-ERK、Nrf2、Trx 和p-JNK、cleaved-caspase-3 的一抗，室溫孵育過夜，第2 天應用 TBST 洗滌3次。并加入相應的二抗，室溫孵育1 h，應用TBST 進行3次洗膜。最后進行熒光顯色操作。ECL 發(fā)光法進行顯影并采集圖像，計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析通過 SPSS 19.0 for Windows 軟件，先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗后，行t檢驗及單向方差分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結果

2.1 FBG 與HOMA-IR 監(jiān)測

結果顯示（圖1），糖尿病模型小鼠第2次STZ腹腔注射第5天，F(xiàn)GB及HOMA-IR均值與正常組（5.86±0.64）mmol/L、2.58±0.21相比開始升高（8.15±0.82）mmol/L、3.96±0.22，HOMA-IR的變化與FGB呈正相關。至ST 注射后第20天，糖尿病小鼠模型建立成功，此時糖尿病組小鼠FGB、HOMA-IR 基本達到糖尿病標準（11.15±1.82）mmol/L、5.14±0.36。至STZ 注 射后第35天，糖尿病組FBG 和HOMA-IR值達實驗最高值（32.60±0.73）mmol/L，17.10±0.25。

2.2 各組小鼠耳蝸毛細胞結構及缺失數(shù)量

耳蝸基底膜SDH 染色觀察（圖2），T2DM 小鼠耳蝸毛細胞與正常Control組相比，體積減小，數(shù)量減少，排列不規(guī)則。耳蝸頂回至底回相等距離（200 μm）內(nèi)、外毛細胞計數(shù)結果顯示，糖尿病組小鼠耳蝸毛細胞與正常組相比，外毛細胞缺失顯著（P＜0.01），內(nèi)毛細胞亦有減少（P＜0.05），說明2型糖尿病耳蝸毛細胞退化，且以底回外毛細胞損傷為主（圖 2）。雷公藤甲素 0.1 mg /kg 處理后T2DM+TPL組與T2DM組相比，內(nèi)、外毛細胞數(shù)量均有不同程度增加（P＜0.05），提示雷公藤甲素可以減輕2型糖尿病小鼠耳蝸毛細胞損傷，對毛細胞退化起保護作用。

2.3 各組小鼠p-ERK/Nrf2/Trx 蛋白的表達

結果顯示（圖3），T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中Trx、Nrf2 和p-Erk 的蛋白表達量有不同程度低于對照組，且T2DM組低于T2DM+TPL組（相應P值為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。而T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中p-JNK 的蛋白表達量均有不同程度的高于對照組，且T2DM組高于T2DM+TPL組（P＜0.01）。各組小鼠ERK、JNK 的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 FBG 與HOMA-IR 分析

圖2 各組小鼠耳蝸基底膜SDH 染色鋪片（A-C，×200）及耳蝸外毛細胞（D）、內(nèi)毛細胞（E）計數(shù)統(tǒng)計分析

2.4 各組小鼠凋亡相關蛋白的表達

結果顯示（圖4），T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中cleaved-caspase-3 的蛋白表達量有不同程度的高于對照組，且T2DM組高于T2DM+TPL組（P＜0.01）。

3 討論

神經(jīng)退行性病變是一種緩慢進展性疾病，包括糖尿病性耳聾、視網(wǎng)膜色素變性、帕金森病等，主要病理變化是神經(jīng)元的退行性變性和凋亡。其發(fā)病機制研究表明，神經(jīng)細胞內(nèi)過度氧化應激產(chǎn)生的氧化還原失衡在神經(jīng)元損傷、死亡中起重要作用[8-9]。2型糖尿病長期高血糖導致晚期AGEs生成增加，AGEs通過與其主要的受體RAGEs結合產(chǎn)生大量ROS促發(fā)氧化應激[10-11]。許多研究表明ROS在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)病過程中起著不可忽視的作用[12]。耳蝸內(nèi)有用來滅活自由基的高水平的抗氧化酶類，其中硫氧還蛋白Trx與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及NADPH 共同構成硫氧還蛋白系統(tǒng)（Trx系統(tǒng)）。Trx系統(tǒng)在清除體內(nèi)過量ROS的過程中起到了非常重要的作用[13]，消除耳蝸處于自由基的高代謝水平。另一方面，外毛細胞側面含有的獨特結構（囊腔結構）是氧自由基產(chǎn)生的關鍵場所及受累的部位[14]。ROS增加導致毛細胞發(fā)生細胞凋亡及丟失[15]。Cleaved-caspase-3表達水平的高低直接反映細胞凋亡程度[16-17]。

Keap1-Nrf2-ARE 通路是細胞抗氧化應激的一個最重要的抗氧化防御機制之一，在生理狀態(tài)下，胞質(zhì)中Keap1-Nrf2 與核心泛素結構CUI3-Rbx1 相互作用，Keap1 作為E3 泛素連接酶，靶向引導Nrf2 的泛素化和降解[18]。氧化應激時Nrf2 被磷酸化或者Keap1 的構象發(fā)生變化，Nrf2 核轉位，介導下游抗氧化蛋白的表達。研究表明Nrf2-ARE 途徑調(diào)節(jié)了Trx 和TrxR 的基因表達[19]。

圖3 各組小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)抗氧化分子蛋白電泳圖（A）；B：Trx 蛋白表達的IOD值分析；C：Nrf2 蛋白表達的IOD值分析；D：p-JNK蛋白表達的IOD值分析；E：p-ERK蛋白表達IOD值分析；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖4 各組小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)凋亡分子蛋白電泳圖（A）和cleaved-caspase-3 蛋白表達的IOD值分析（B）；＊＊P＜0.01

凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1），屬于絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成員，c-jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是ASK1 下游的重要凋亡分子。ASK1-JNK信號通路是促進細胞凋亡的一條重要的信號轉導通路。

正常條件下Trx與Ask1的N末端結合形成Trx-ASK1 復合物抑制Ask1 的活性及其介導的細胞凋亡。在氧化應激時，Trx 從Trx-Ask1 的復合物中釋放，活化的Ask1 激活下游凋亡信號通路，引起細胞凋亡和炎癥[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)Trx 通過其氧化還原作用抑制凋亡信號途徑，從而對視網(wǎng)膜起到神經(jīng)保護作用[21]。

本研究結果表明，糖尿病組小鼠耳蝸毛細胞與正常組比較體積小、數(shù)量少，排列松散且不規(guī)則；Trx表達降低，而凋亡分子cleaved-caspase-3表達升高。提示糖尿病長期高血糖及AGEs 聚積所致的氧化應激導致了耳蝸毛細胞內(nèi)退行性變性和凋亡，引起耳蝸毛細胞損傷。同時抗氧化相關信號通路Nrf2/Erk1/2 被抑制，而JNK信號通路被激活。

同時，雷公藤甲素組小鼠耳蝸毛細胞與糖尿病組比較體積增大，數(shù)量增多，排列規(guī)則；耳蝸組織中的抗氧化分子ERK 磷酸化、Nrf2、Trx表達升高，JNK 磷酸化和凋亡分子cleaved-caspase-3表達降低。表明雷公藤甲素可通過激活 p-ERK 和Nrf2 /Trx 抗氧化信號通路，抑制JNK信號減輕糖尿病高血糖所致的耳蝸毛細胞氧化應激延緩耳蝸毛細胞的凋亡，對耳蝸毛細胞具有保護作用。

綜上所述，雷公藤甲素能減輕糖尿病耳蝸毛細胞氧化應激損傷誘導的細胞凋亡，其機制可能調(diào)控了ERK、JNK 和Nrf2信號通路有關，有望成為治療2型糖尿病耳蝸毛細胞損傷的有效藥物。