黃 煌 林逕蒼 呂國榮 許險艷 許相洋

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，泉州 362000）

Barker 等[1-2]在20 世紀(jì)90年代指出，成年時期的某些疾病有可能來源于“胚胎”，例如胎兒時期氧氣、營養(yǎng)等環(huán)境因素會影響胚胎早期發(fā)育，導(dǎo)致成年期的某些代謝性疾病會被程序性控制[3-5]。胰島素樣生長因子-l（insulin-like growth factor-l，IGF-1）主要在肝產(chǎn)生，游離的IGF-1 可以結(jié)合相應(yīng)的受體，促進脂肪的合成，且抑制其分解，使游離脂肪酸溶度降低。另外IGF-1 有促進物質(zhì)代謝、降低血糖、促進生長發(fā)育等生理功能。非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）鏡下主要病理特征是彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性，其特征與酒精性脂肪性肝?。╝lcoholic fatty liver disease，AFLD）相似，但NAFLD一般無過量飲酒史。課題組前期研究表明，NAFLD發(fā)生發(fā)展的程度與IGF-l的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[6-7]，NAFLD仔鼠用高脂飲食飼養(yǎng)顯示其肝細(xì)胞IGF-1 mRNA水平明顯比正常仔鼠低[8-9]。本研究建立孕大鼠缺氧模型，觀察慢性間斷性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）對子代1 d齡雄仔鼠肝細(xì)胞作用及IGF-1基因組蛋白修飾和表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康SD大鼠24只，懷孕齡7d，體質(zhì)量175～195 g，購自上海斯萊克公司[許可證：SCXK（滬）2007000569092]。辣根酶標(biāo)記兔抗羊IgG、SP兩步法試劑盒、real-time PCR試劑、免疫蛋白印跡試劑、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試劑等購自福州鼎鑫泰斯特科技有限公司；兔抗大鼠IGF-1抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 CIH 模型制備及動物分組

SD 孕大鼠24 只隨機分為對照組和缺氧組，每組12只。對照組于40%～70%相對濕度，溫度18℃～25℃塑料籠（帶不銹鋼蓋）內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝水，自然采光；缺氧組置入缺氧箱飼養(yǎng)，及時調(diào)整O2、N2流量，用小風(fēng)扇將箱內(nèi)的空氣不斷地混勻，將O2濃度控制在10.0%±0.5%（對照組O2濃度為21%）。缺氧箱內(nèi)、外借箱壁的小孔溝通，箱內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。每天8 h 維持這種狀態(tài)，即上 午6：30—10：30、下 午15：30—19：30。重復(fù)至妊娠第21 天。待產(chǎn)孕鼠分籠，每只孕鼠分娩仔鼠12～13 只，分娩得到12 窩對照組仔代大鼠156 只，12 窩缺氧組仔代大鼠153只。2組孕鼠平均產(chǎn)仔數(shù)及胎鼠存活率、雌雄比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因雌激素可干擾機體脂質(zhì)代謝水平[10]，故本研究采用日齡1 d 的雄仔鼠。

分娩后，隨機選取對照組、缺氧組各30只日齡1 d 的雄仔鼠，麻醉處死后取肝組織標(biāo)本，分別做ChIP 檢測、real-time PCR、免疫蛋白印跡、電鏡檢查、免疫組織化學(xué)檢查，每項標(biāo)本各6只。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測肝組織IGF-1表達(dá)

常規(guī)石蠟標(biāo)本制片，采用免疫組織化學(xué)顯色檢測肝組織IGF-1 蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書操作。一抗及二抗工作濃度均為1：100。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，運用Image-Pro Plus 6.0型圖像處理分析軟件，測定切片平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.4 電子顯微鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)

取2組1 d 齡的雄仔鼠肝組織，置于3%戊二醛中，放于4℃2 h 以上，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗，共3次；標(biāo)本置于1%鋨酸，4℃1.5 h，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗3次，乙醇脫水；經(jīng)過浸透、包埋和聚合后，用超薄切片機切片，染色后水洗，電鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)。

1.5 Real-time PCR 檢測肝組織 IGF-1 mRNA 水平

提取1 d 齡雄仔鼠肝組織，使用TRIzol 法抽提肝組織總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行定量PCR 反應(yīng)。根據(jù) Genebank 的數(shù)據(jù)庫（Primer 5.0）設(shè)計引物序列。IGF-1基因上游引物序列為5'-TTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTT-3'，下游引物序列為 5'-CTTCTCCTTTCTCTGTGTTG -3'；內(nèi)參β-actin 上游引物序列為5'-GGCTCTCTGCTCCTC C-3'，下游引物序列為5'-CCGTTCACACCGACT T-3'。Real-time PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，54℃退火30 s，68℃延伸30 s，共 30個循環(huán)；68℃延伸 10 min；95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。采用公式2-ΔΔCT計算mRNA表達(dá)量。

1.6 免疫蛋白印跡檢測IGF-1 蛋白表達(dá)水平

取2組1 d齡雄仔鼠肝組織標(biāo)本，依照 RIPA說明書進行免疫蛋白印跡檢測。其主要的步驟為：肝組織總蛋白提取、蛋白質(zhì)變性樣品與加樣、分離膠和濃縮膠的配置、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳灌膠和上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)、ECL 反應(yīng)及膠片曝光、凝膠圖像分析。掃描獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為蛋白相對表達(dá)量。

1.7 ChIP 檢測IGF-1組蛋白

ChIP 為可以快速反映蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的表觀遺傳學(xué)的技術(shù)。其主要步驟為：穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物、分離核組分；超聲處理使染色質(zhì)片段化（長度200～1 000 bp）；使用目的蛋白特異性抗體（表1）捕獲蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)，抗體免疫沉淀，并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)；解交聯(lián)并且純化 DNA，以染色質(zhì)免疫沉淀所得DNA 為模板，使用IGF-1基因各位點引物用real-time PCR 法定量各組蛋白修飾的水平。選擇GAPDH 序列為內(nèi)參照。經(jīng)檢測該序列含有所有5 種共價修飾引物序列（表2）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 組蛋白修飾抗體

2 結(jié)果

2.1 妊娠期缺氧動物模型的建立

缺氧組孕鼠的動脈血氧分壓、氧濃度和對照組孕鼠比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但缺氧組孕鼠和對照組孕鼠血液中CO2分壓及pH值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3），提示CIH模型建立成功。缺氧組孕鼠母體受缺氧應(yīng)激，僅出現(xiàn)低氧血癥。

表2 共價修飾引物序列

表3 孕鼠動脈血氣分析比較（n=12，±s）

表3 孕鼠動脈血氣分析比較（n=12，±s）

*P＜0.05 vs 對照組

組別 血氧分壓（kPa）氧濃度（%）二氧化碳分壓（kPa）pH值對照組 11.29±2.68 92.6±8.1 6.22±1.25 7.4±1.1缺氧組 7.14±2.75* 75.3±3.4* 5.90±2.17 7.3±2.5

2.2 子代1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1 的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，對照組1 d 齡雄仔鼠的肝IGF-1表達(dá)水平（3.66±0.71）高于缺氧組（1.83±0.51），IGF-1 主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)（圖1）（P＜0.05）。

圖1 對照組（A）及 缺氧組（B）1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1 的表達(dá)，免疫組織化學(xué)顯色，×100

2.3 子代1 d 齡雄仔鼠肝的超微結(jié)構(gòu)

電鏡下形態(tài)學(xué)顯示，對照組肝超微結(jié)構(gòu)無明顯異常（圖2A），缺氧組肝超微結(jié)構(gòu)基本正常，偶爾在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪滴（圖2B）。

2.4 子代1d 雄仔鼠肝組織IGF-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果表明，對照組IGF-1 mRNA水平（0.928 873±0.012 445）高于缺氧組（0.503 444±0.010 900），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

對照組IGF-1 蛋白（1.878 47±0.038 63）表達(dá)水平顯著高于缺氧組（0.903 23±0.038 32），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 IGF-1基因組蛋白ChIP 測序

2.5.1 Proximal 3'UTR基因 ChIP測序結(jié)果顯示（圖4），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Proximal 3'UTR片段H3K9me3、H3K4me3、H3k14ac、H3K36me3、H3K4me2組蛋白的修飾，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但H3K9ac組蛋白修飾差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明缺氧組肝組織IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段組蛋白H3K9ac 乙?；潭容^對照組顯著降低（圖4）。

圖2 對照組（A）及缺氧組（B）子代1 d 齡雄仔鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)比較，透射電鏡，×4 000

圖3 免疫蛋白印跡檢測子代1 d 齡雄仔鼠肝組織中IGF-1 的表達(dá)（n=3）

圖4 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段組蛋白修飾對比圖

2.5.2 P1基因 ChIP測序結(jié)果顯示（圖5），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因P1片段的組蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修飾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5.3 P2基因 ChIP測序結(jié)果顯示（圖6），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因P2片段組蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修飾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 1 d 齡雄仔鼠肝組織IGF-1基因P1 片段組蛋白修飾對比圖

圖6 1 d 齡雄仔鼠肝組織IGF-1基因P2 片段組蛋白修飾對比圖

2.5.4 Exon 5基因 ChIP測序結(jié)果顯示（圖7），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Exon 5片段的H3K36me3、H3K14ac、H3K4me3、H3K4me2、H3K9me3組蛋白修飾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），但H3K9avs位點組蛋白修飾差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明缺氧組肝IGF-1基因Exon 5片段組蛋白H3K9ac乙?；潭容^對照組顯著降低。

2.5.5 Distal 3'UTR基因 ChIP測序結(jié)果顯示（圖8），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Distal 3'UTR片段 的H3K9me3、H3K36me3、H3K4me3、H3K4me2、H3K14ac組蛋白修飾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但H3K9ac組蛋白修飾差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示缺氧組肝IGF-1基因Distal 3'UTR片段組蛋白H3K9ac 乙?；潭容^對照組顯著降低。

圖7 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Exon 5 片段組蛋白修飾對比圖

圖8 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Distal 3'UTR 片段組蛋白修飾對比圖

3 討論

產(chǎn)前的缺氧是臨床最重要、最相關(guān)的刺激，很多病理狀況與宮內(nèi)缺氧關(guān)系密切，如母體貧血、吸煙、胎盤功能不全、哮喘、先兆子癇等[11-12]。目前有一些學(xué)者使用動物模型進行相關(guān)的實驗研究，如孕期宮內(nèi)慢性缺氧等動物模型[13]。課題組前期根據(jù)母體慢性宮內(nèi)缺氧和子代成年疾病有關(guān)的假說進行相關(guān)研究，取得一些研究結(jié)果[14-17]。本研究進一步采用已經(jīng)成熟的動物模型[18-20]，研究CIH 對子代大鼠肝發(fā)育及IGF-1表達(dá)的影響。CIH 模型缺氧組孕鼠采用的氧濃度為10.0%±0.5%，范圍和臨床實踐中先兆子癇、妊高癥等常導(dǎo)致胎兒缺氧的氧濃度相互吻合，可模擬臨床實踐中的胎兒缺氧狀況。結(jié)果顯示，缺氧組的孕鼠沒有出現(xiàn)CO2潴留、酸中毒，僅有低氧血癥現(xiàn)象，缺氧組孕鼠僅受缺氧因素作用，說明造模成功。

課題組用 SD大鼠制作CIH動物模型，觀察持續(xù)到仔鼠的成年期（5月齡），妊娠期缺氧也顯著升高缺氧組雄性仔鼠甘油三酯、血清胰島素、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素抵抗指數(shù)，游離脂肪酸等，與前期實驗結(jié)果一致，出現(xiàn)大鼠機體胰島素抵抗[18-20]。前期研究結(jié)果顯示，CIH可引起胎鼠生長緩慢，伴隨主要器官的生長不成比例，低出生體質(zhì)量仔鼠。但缺氧組出生后出現(xiàn)趕超性生長，生后 20 d左右，缺氧組仔鼠體質(zhì)量追趕上對照組，出現(xiàn)出生后缺氧組追趕性生長的現(xiàn)象，此現(xiàn)象可能是缺氧組仔鼠成年期的肝脂質(zhì)大量快速沉積的原因之一[14-20]。

IGF-l 是受到表觀遺傳調(diào)控的可以介導(dǎo)調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育的基因，人類IGF-1基因結(jié)構(gòu)和大鼠有很高的相似度。有學(xué)者研究顯示，宮內(nèi)不良的環(huán)境可導(dǎo)致大鼠肝IGF-1 表觀遺傳學(xué)表現(xiàn)發(fā)生改變[21-22]。表觀遺傳學(xué)指在核苷酸序列沒有發(fā)生改變時，研究基因表達(dá)的可遺傳變化。對于環(huán)境變化，表型已經(jīng)發(fā)生改變，但基因型沒有改變，在細(xì)胞分裂過程中能保持相對穩(wěn)定，并且可以隨機發(fā)生。表觀遺傳現(xiàn)象已知有組蛋白共價修飾、DNA 甲基化等。染色質(zhì)的最基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，其核心由H2A、H2B、H3 和H4組蛋白組成為八聚體，147 bp 的DNA 纏繞于八聚體外周。氨基末端（N端）在八聚體核心外周延伸出來，翻譯后可以產(chǎn)生共價修飾。最重要的修飾方式有乙酰化、甲基化等，這些共價修飾可以影響染色質(zhì)的構(gòu)象、基因表達(dá)。組蛋白去乙酰基酶及組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶可以催化組蛋白乙?；?。通常情況下，核小體組蛋白高乙?；癄顟B(tài)，為轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)；低乙?；癁椴晦D(zhuǎn)錄活躍區(qū)[23-25]。

本研究采用ChIP 技術(shù)檢測對照組和缺氧組肝IGF-1基因的組蛋白修飾，其中對于Exon 5、Proxima1 3'UTR、Distal 3'UTR、Pl、P2 片段的位點H3K9me3、H3K4me3、H3K14ac、H3K36me3、H3K4me2、H3K9ac 的組蛋白修飾進行檢測。結(jié)果提示，慢性宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致了缺氧組肝組織IGF-1基因的Proximal 3'UTR、Exon 5、Distal 3'UTR 片段的H3K9ac組蛋白乙?；矁r修飾的水平顯著降低，IGF-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，IGF-1 蛋白表達(dá)水平降低。且缺氧組肝可見少量脂肪滴，提示有脂肪代謝障礙，推測發(fā)生NAFLD。

綜上所述，CIH 可致缺氧組肝IGF-1基因表觀遺傳機制改變，可能參與宮內(nèi)缺氧后雄性仔鼠非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展過程。