王紅梅，李文悌，莊春波，張世杰，李興武

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

男性原因引起的不孕不育占整個(gè)不孕不育的近50%。圓頭精子癥(globozoospermia)是一種嚴(yán)重且罕見(jiàn)的精子畸形[1-2]，在男性不育癥中占比不足0.1%，主要表現(xiàn)為精子頭部呈正圓形，頂體缺陷或缺失，伴隨尾部異常[3-4]，由于其頂體酶減少或缺失從而使得精子不能順利穿過(guò)卵子透明帶，不能與卵子結(jié)合而引起不育。圓頭精子癥產(chǎn)生的確切原因與機(jī)制還不十分明確，有報(bào)道[5-7]其與多種基因異常有關(guān)，如精子發(fā)生相關(guān)基因16 (spermato-genesis associated 16，SPATA16)、編碼跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白的基因DPY19L2等。本研究對(duì)1例圓頭精子癥患者的精液進(jìn)行常規(guī)分析和形態(tài)學(xué)觀察，并利用全外顯子測(cè)序技術(shù)探討其基因變異情況。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象男性，34歲，婚后8 a(未采取避孕措施5 a)未育，體格健壯。泌尿外科常規(guī)體檢：第二性征明顯,無(wú)過(guò)敏史,無(wú)心、肺、肝等實(shí)質(zhì)臟器疾患,無(wú)吸煙、酗酒等不良習(xí)慣；B超示睪丸、輸精管、附睪、精索靜脈均正常；傳染病四項(xiàng)均陰性，促卵泡生成素(FSH)、泌乳素(PRL)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、黃體酮(PROG)、睪酮(TESTO)均正常，遺傳核型為46,XY，精漿生化檢測(cè)(酸性磷酸酶、中性α-糖苷酶、果糖、乳酸脫氫酶X)均正常，精子頂體酶活性降低，為45.7 μIU/106個(gè)精子(參考值≥64.9 μIU/106個(gè)精子)。禁欲5 d后手淫取精液于專用無(wú)菌大試管中，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行精子質(zhì)量分析和形態(tài)學(xué)分析。同時(shí)選取健康有生育能力的志愿者的精液一并做形態(tài)學(xué)分析。本研究已通過(guò)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研和臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審查，倫理審查編號(hào)：2019-KY-131。

1.2精液常規(guī)分析及精子形態(tài)學(xué)分析按第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，分別取患者和志愿者精液2 μL滴于進(jìn)口專用計(jì)數(shù)池，置于西班牙SCA精子質(zhì)量分析系統(tǒng)進(jìn)行精子質(zhì)量分析。分別將患者精液及志愿者精液2 μL滴于GoldCyto Spermblue精子形態(tài)染色分析玻片上，用加樣槍尖順時(shí)針、逆時(shí)針適當(dāng)攪動(dòng)，使標(biāo)本與染液充分混合，加一次性蓋片，56 ℃加熱5 min，置OlympusCX31顯微鏡(×100)下觀察并計(jì)數(shù)異常形態(tài)精子數(shù)，計(jì)算精子頭部畸形率及圓頭精子率。

1.3全外顯子測(cè)序取患者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，送上海明碼生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行基因全外顯子測(cè)序。測(cè)序流程如下：提取外周全血基因組DNA，依次進(jìn)行末端補(bǔ)平、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇及擴(kuò)增，完成 DNA 文庫(kù)構(gòu)建。然后使用安捷倫全外顯子組目標(biāo)區(qū)域捕獲探針進(jìn)行雜交，使用磁珠捕獲雜交的目的片段并分離純化。PCR擴(kuò)增捕獲的DNA 片段并純化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行捕獲文庫(kù)質(zhì)檢。調(diào)整待測(cè)DNA文庫(kù)濃度，按照Illumina的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行高通量測(cè)序。最后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用ClinVar、OMIM 和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選可疑的致病變異。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DPY19L2基因拷貝數(shù)變異分別取患者及健康對(duì)照者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝。采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取患者血液基因組DNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ reagent (TaKaRa公司) 試劑盒檢測(cè)DPY19L2基因拷貝數(shù)相對(duì)水平。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，DPY19L2上游引物5’-TAGCCAAGGGAAGCCGTGAT-3’，下游引物5’-AGCCATGTGCGGGATGTAAT-3’, 由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL、10 μL TB Green、2 μL DNA模板、0.4 μL ROX以及6 μL無(wú)核酸酶水。PCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以健康男性基因組DNA為對(duì)照，采用2-ΔCt(ΔCt=Ct患者-Ct對(duì)照)法計(jì)算患者DPY19L2基因拷貝數(shù)相對(duì)水平?；颊吆徒】祵?duì)照樣本各做3個(gè)復(fù)孔。

1.5Sanger測(cè)序檢測(cè)單核苷酸變異取患者靜脈血3 mL,抗凝，提取基因組DNA。根據(jù)DNAH1基因NM_015512.4:c.871+3G>A和ZMYND10基因NM_015896.2:c.833G>C 變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物。DNAH1上游引物5’-GCTTTCTTCCAGGTATTT GACAA-3’，下游引物5’-TGTCTACCAGCTGAGAG GTCTTG-3’；ZMYND10上游引物5’-AAAAGAG CACTGGGGTTGAG-3’，下游引物5’-GCTGGCT CACTTGAAGAGAATT-3’。使用 PCR 擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL，10 μL TB green，2 μL DNA模板，0.4 μL ROX以及6 μL無(wú)核酸酶水。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1精液常規(guī)分析及精子形態(tài)分析結(jié)果精液pH 7.5，精子活動(dòng)率56.0%，前向運(yùn)動(dòng)(PR)：22.4%，非前向運(yùn)動(dòng)(NP)：33.6%，無(wú)運(yùn)動(dòng)(IM)：44.0%。精子密度32.7×106個(gè)/mL。 精子形態(tài)分析結(jié)果：精子頭部畸形率100%，均為圓頭精子，缺乏頂體(圖1)。

圖1 患者(左)和健康對(duì)照(右)的精子形態(tài)

2.2全外顯子測(cè)序結(jié)果分析及驗(yàn)證該患者DPY19L2基因區(qū)域測(cè)序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失，并攜帶DNAH1(c.871+3G>A)和ZMYND10 (c.833G>C，p.Arg278Pro)基因雜合突變。與健康對(duì)照相比，該患者DPY19L2基因拷貝數(shù)相對(duì)水平明顯降低，僅為正常水平的30%[(0.293±0.109)vs(1.001±0.025)]，提示存在DPY19L2基因純合缺失。此外，對(duì)單核苷酸變異的驗(yàn)證結(jié)果顯示，該患者確攜帶DNAH1基因c.871+3G>A雜合突變和ZMYND10 基因c.833G>C雜合突變(圖2)。

A：患者DNAH1基因存在c.871+3G>A雜合突變；B：DNAH1正?；蛐?；C：患者ZMYND10基因存在c.833G>C雜合突變；D：ZMYND10正常基因型

3 討論

雖然圓頭精子癥在不育男性中的發(fā)病率低于0.1%，但臨床上并不十分罕見(jiàn)，根據(jù)嚴(yán)重程度可分為兩種類型：Ⅰ型，精子頭部完全不存在頂體和頂體酶；Ⅱ型，精子保留殘余頂體或存在其他形態(tài)類異常。安娜等[8]曾在透射電鏡下觀察圓頭精子的超微結(jié)構(gòu)，顯示精子質(zhì)膜破損，頂體缺失，細(xì)胞核內(nèi)含有空泡，線粒體空泡化且排列雜亂，堆疊在一起，微管的9+2結(jié)構(gòu)不明顯，精子頸部或尾部卷曲。用超高倍精子放大系統(tǒng)或傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡雖然無(wú)法觀察精子內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，卻能較清晰地觀察精子的外部形態(tài)，染色后能清晰地觀察到精子頂體、胞核，以及空泡等，圓頭精子卻看不到頂體。由于頂體內(nèi)含有精子與卵母細(xì)胞受精所需要的酶類，因此在女性體內(nèi)缺乏頂體的異常精子不能順利穿過(guò)卵子的透明帶，就無(wú)法使卵母細(xì)胞受精，患者表現(xiàn)為不育[9]。

關(guān)于圓頭精子癥導(dǎo)致男性不育的確切機(jī)制目前尚不明確，文獻(xiàn)[10]報(bào)道顯示超過(guò) 80%的圓頭精子癥的發(fā)生是由于DPY19L2基因缺失導(dǎo)致。Alvarez等[11]的研究顯示，DPY19基因家族包括4個(gè)基因：DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3和DPY19L4。DPY19L2基因的突變導(dǎo)致功能性DPY19L2蛋白的喪失，可導(dǎo)致精子生成障礙9型[MIM：613958]，從而導(dǎo)致精子頭部延長(zhǎng)和頂體發(fā)育障礙。但是，圓頭精子癥患者除不育之外，并未發(fā)現(xiàn)其他特殊癥狀和體征，染色體和Y染色體微缺失均未見(jiàn)異常。本研究未檢測(cè)到明確的導(dǎo)致圓頭精子癥的致病基因或變異，也未發(fā)現(xiàn)與其表型相關(guān)的點(diǎn)變異及小片段插入缺失變異，卻發(fā)現(xiàn)DPY19L2基因部分區(qū)域測(cè)序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失。該大片段缺失變異曾在多例圓頭精子癥患者中被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。Koscinski等[10]對(duì)4例圓頭精子癥患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DPY19L2基因有約200 kb的純合缺失。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，54名圓頭精子癥患者中多名患者受累于該基因的純合缺失。該患者精液常規(guī)分析均在正常值范圍內(nèi)。

該研究結(jié)果同時(shí)顯示全外顯子測(cè)序檢測(cè)到DNAH1基因、ZMYND10基因存在變異，其基因變異信息分別為NM_015512.4:c.871+3G>A和NM_015896.2:c.833G>C(p.Arg278Pro)，均屬于雜合子突變，分別可能引起精子生成障礙18型[13][MIM:617576]和原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙22型[14][MIM:615444]，表現(xiàn)為精子鞭毛的多種形態(tài)學(xué)缺陷和男性不育，然而這兩個(gè)基因變異目前尚不能判定與圓頭精子癥有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

總之，圓頭精子癥基因缺陷表現(xiàn)多樣，DPY19L2基因純合缺失可能是本例圓頭精子癥的發(fā)病原因。