趙源征，楊卓瀅，何遠(yuǎn)宏，孫若楠，苑和平

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

腦卒中是我國(guó)最常見(jiàn)的腦血管病之一，分為缺血性卒中和出血性卒中。缺血性卒中即腦梗死最為常見(jiàn)?；颊叨嘤懈杏X(jué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙，認(rèn)知功能障礙和這些障礙給生活帶來(lái)極大不便。腦梗死目前的有效治療仍是超早期的溶栓治療以及后續(xù)的對(duì)癥藥物治療和康復(fù)治療，條件十分有限且治療效果欠佳[1-2]。尼可地爾(2-煙酰胺乙基-硝酸鹽酯)是一種ATP敏感型鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)開(kāi)放劑，同時(shí)具有類(lèi)硝酸酯活性，臨床上主要用于心臟疾病的治療。近來(lái)有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)尼可地爾在血管性癡呆，亨廷頓病等腦部疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究通過(guò)建立大鼠腦梗死模型，探討尼可地爾對(duì)神經(jīng)元再生的作用和機(jī)制，為腦梗死的臨床藥物研究提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器尼可地爾(北京四環(huán)科寶制藥有限公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，美國(guó)Sigma公司)，大鼠用大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)線栓(北京西濃科技有限公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京康為試劑生物科技有限公司)，小鼠抗大鼠BrdU(抗體美國(guó)CST公司)，兔抗大鼠NeuN抗體、驢抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、PCR所用引物的設(shè)計(jì)(上海生工生物工程有限公司)。冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡儀器有限公司)，Western blot電泳及轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)BIO-RAD儀器有限公司)，PCR儀(德國(guó)Eppendorf有限公司)，熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS光學(xué)儀器有限公司)。

1.2大鼠MCAO模型[5]的建立及分組處理90只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重200～240 g，分為3組：假手術(shù)組、腦梗死組和尼可地爾組，每組30只。大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，頸部備皮、消毒，沿正中線剪開(kāi)皮膚，小心剝離組織，露出右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，活結(jié)結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在動(dòng)脈間剪一小口，將線栓小心送入，直至大腦中動(dòng)脈起始段，長(zhǎng)度約為(20.0±2.0)mm，停止線栓送入，1.5 h后拔出線栓尾端約10 mm，假手術(shù)組線栓送入大腦中動(dòng)脈起始段后立馬拔出，其余步驟同另外兩組。手術(shù)期間使用恒溫加熱墊，使大鼠體溫保持在37 ℃左右。Zea-Longa法評(píng)分1～3分為造模成功。尼可地爾為粉末狀，溶于生理鹽水中，術(shù)后24 h按7.5 mg/(kg·d)的劑量給尼可地爾組大鼠灌胃，其余組給予同等劑量的生理鹽水[6]，直至實(shí)驗(yàn)前1天。腦梗死組和尼可地爾組自術(shù)后24 h開(kāi)始腹腔注射BrdU，劑量為50 mg/kg，連續(xù)注射13 d[7]。

1.3神經(jīng)功能缺損評(píng)分術(shù)后第1、3、7、14天，腦梗死組和尼可地爾組每組取10只大鼠。按照Z(yǔ)ea-Longa標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)兩組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。0分：正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)(癱瘓側(cè))前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。

1.4腦含水量測(cè)定術(shù)后第3天，各組取6只大鼠麻醉，快速取腦，剝離梗死側(cè)大腦半球，立即稱(chēng)重，以獲得濕重。隨后在100 ℃的干燥箱內(nèi)烘干24 h，再次稱(chēng)重，獲得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。

1.5TUNEL法[10]檢測(cè)大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)細(xì)胞凋亡術(shù)后第3天，每組取6只大鼠，用PBS、體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛灌注心臟，至大鼠全身僵硬，快速取腦，放于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定后，再置體積分?jǐn)?shù)30%蔗糖中直至沉底。OCT包埋，20 μm厚冰凍切片。取腦片，室溫下放置于PBS中漂洗3次(10 min/次)，37 ℃濕盒中避光孵育，置于TUNEL混合液中1 h，再次置于PBS中漂洗，滴加DAPI，封片，顯微鏡(×400)下觀察梗死周?chē)鷧^(qū)細(xì)胞凋亡情況。每張切片選擇3個(gè)視野，Image J軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.6腦組織BrdU/NeuN免疫熒光雙染檢測(cè)術(shù)后第14天，每組取6只大鼠，快速取腦，制作20 μm厚的冰凍切片。取腦片置于PBS中漂洗3次(5 min/次)，37 ℃下置于2 mol/L鹽酸溶液15 min，于0.1 mol/l硼酸溶液漂洗3次(10 min/次)[11]。PBS漂洗，PBST溶液處理30 min，體積分?jǐn)?shù)1%BSA封閉30 min。加小鼠抗大鼠BrdU一抗(按照1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱過(guò)夜。PBS漂洗，驢抗小鼠二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h。PBS漂洗，體積分?jǐn)?shù)1%BSA封閉30 min，再加兔抗大鼠NeuN(按照1∶300稀釋)，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS漂洗，山羊抗兔二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h，PBS漂洗，滴加DAPI，封片。熒光顯微鏡下觀察染色情況。每個(gè)切片選擇梗死周?chē)鷧^(qū)域的3個(gè)不重疊的區(qū)域，Image J軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.7大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)NeuN的mRNA的RT-PCR檢測(cè)術(shù)后第14天，3組各取6只大鼠(來(lái)自1.3實(shí)驗(yàn)后)，深度麻醉后，快速取腦，剝離梗死周?chē)鷧^(qū)組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列如下：NeuN上游5’-CCCTCCCTCAGCAGACAC-3’，下游5’-TCAGCAGCCGCATAGACTCTACC-3’；GAPDH上游5’-GACATGCCGGGAGAAAC-3’，下游 5’-AGC CCAGGATACCCTTTAGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s, 61 ℃退火30 s, 75 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離。凝膠使用Alpha Innotech成像儀(BIO-RAD)進(jìn)行分析。以目的基因條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)NeuN蛋白的Western blot檢測(cè)術(shù)后第14天，3組各取6只大鼠(4只來(lái)自1.3實(shí)驗(yàn)后,2只為另取)，麻醉后，快速取腦，剝離出梗死周?chē)鷧^(qū)組織，與RIPA裂解液充分混勻，置于勻漿機(jī)上充分勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心[12]。吸取上清液，加入5×SDS上樣緩沖液煮沸后離心，再次吸取上清液，置-80 ℃冰箱備用。蛋白樣品用80 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白小心轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，TBST漂洗3次(10 min/次)，4 ℃冰箱孵育兔抗大鼠NeuN一抗(按照1∶5 000稀釋)過(guò)夜，TBST漂洗3次(10 min/次)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(按照1∶2 000稀釋)后室溫孵育1 h，TBST漂洗后，加入ECL發(fā)光液，置于光密度成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶情況并拍照，以GAPDH作內(nèi)參。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析；3組大鼠腦含水量，梗死周?chē)鷧^(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)、BrdU/NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NeuN mRNA和蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Zea-Longa評(píng)分(n=10)

與腦梗死組相比，尼可地爾組在第3、7、14天的評(píng)分明顯降低。且隨著時(shí)間的推移，兩組腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均有下降的趨勢(shì)。

2.23組大鼠腦含水量及梗死周?chē)鷧^(qū)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)比較結(jié)果見(jiàn)表2。腦梗死組較假手術(shù)組腦含水量明顯升高；與腦梗死組相比，尼可地爾組腦含水量明顯降低。假手術(shù)組僅見(jiàn)到少數(shù)凋亡細(xì)胞，而腦梗死組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，尼可地爾組較腦梗死組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯降低。

2.33組大鼠腦組織BrdU/NeuN的免疫熒光雙染結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

表2 3組大鼠腦含水量及凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)(n=6)

A：假手術(shù)組；B：腦梗死組；C：尼可地爾組；1：BrdU(紅色)；2：NeuN(綠色)；3：Merged(橙色)

2.43組大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)NeuN mRNA和蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)表3。假手術(shù)組NeuN的mRNA以及蛋白含量較低，腦梗死組NeuN的mRNA以及蛋白含量明顯增加；尼可地爾組NeuN的mRNA以及蛋白含進(jìn)一步升高。

表3 3組大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)NeuN的mRNA和蛋白表達(dá)的比較(n=6)

3 討論

腦梗死為腦部血管狹窄、閉塞或供血不足，使得血管支配區(qū)域腦組織缺血壞死，神經(jīng)功能受到破壞。梗死區(qū)中心部分的細(xì)胞缺血壞死，難以逆轉(zhuǎn)，梗死中心區(qū)周?chē)膮^(qū)域被稱(chēng)為缺血半暗帶，其中的細(xì)胞大部分處于休眠狀態(tài)或半休眠狀態(tài)，僅能維持自身形態(tài)的完整，而無(wú)法行使正常功能[13]，拯救“缺血半暗帶”是臨床治療腦梗死的關(guān)鍵。本研究把重點(diǎn)區(qū)域固定在缺血半暗帶。

尼可地爾具有激活KATP通道的活性，同時(shí)具有類(lèi)硝酸酯活性[14]。KATP通道是一種ATP敏感型鉀通道，開(kāi)閉受胞內(nèi)ATP/ADP比值的調(diào)節(jié)，其活性可被ATP抑制并被ADP激活。腦缺血時(shí)，ATP水平降低，KATP通道激活，引起細(xì)胞膜超極化，細(xì)胞興奮性降低，因此可以通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制來(lái)穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)神經(jīng)元電活動(dòng)和能量代謝的平衡[15]。同時(shí)，尼可地爾具有的類(lèi)硝酸酯作用，可以通過(guò)釋放一氧化氮，起到擴(kuò)張血管的作用。既往有研究[16]表明，尼可地爾可以通過(guò)增加腦血流量起到神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明尼可地爾組第3、7、14天的神經(jīng)缺損明顯減輕，證明尼可地爾改善了腦梗死后的神經(jīng)功能，促進(jìn)其恢復(fù)。同時(shí)，腦含水量反映腦水腫的程度，腦水腫的程度可以反映腦部的炎癥情況，以及血腦屏障的通透性被破壞的程度。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第3天(腦軟化期)尼可地爾組腦水腫明顯減輕。尼可地爾可能是通過(guò)激活KATP通道，膜電位回到靜息態(tài)，細(xì)胞興奮性降低，減少了興奮性遞質(zhì)谷氨酸的釋放，抑制了Na+、Ca2+的大量?jī)?nèi)流，進(jìn)而減輕了腦水腫[14]。

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，在神經(jīng)系統(tǒng)中占有重要地位。本研究用BrdU標(biāo)記增殖的細(xì)胞，用NeuN標(biāo)記成熟的神經(jīng)元。BrdU是一種合成的胸腺嘧啶類(lèi)似物，可替代胸腺嘧啶并在DNA合成的S階段滲透到復(fù)制的DNA分子中。如果靶細(xì)胞同時(shí)被兩種標(biāo)記物標(biāo)記，則我們將其視為雙陽(yáng)性細(xì)胞，代表新增殖的神經(jīng)元[17-18]。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第14天，尼可地爾組大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)呈現(xiàn)更多的雙陽(yáng)性細(xì)胞，表明尼可地爾促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。這可能和激活KATP通道的活性有關(guān)。既往有研究[19]表明，KATP通道開(kāi)放劑會(huì)促進(jìn)神經(jīng)再生，具體機(jī)制可能是通過(guò)減少炎癥化合物的形成。本研究結(jié)果亦顯示尼可地爾的使用可以提高大鼠腦梗死周?chē)鷧^(qū)NeuN mRNA和蛋白的含量。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)尼可地爾的處理能明顯減少凋亡，這可能是由于激活了KATP通道，然后一方面通過(guò)維持離子穩(wěn)態(tài)，另一方面通過(guò)降低細(xì)胞的能量需求，延緩一些有害的分解代謝過(guò)程的激活，減少由此帶來(lái)的酶系統(tǒng)的激活而引起的不可逆的細(xì)胞損傷[20-21]。

綜上所述，尼可地爾可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、減輕腦水腫、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元再生來(lái)達(dá)到神經(jīng)保護(hù)，進(jìn)而為腦梗死的臨床治療提供參考。