朱葉，譚秋凡，鞏倩文，胡曉建，陳世豪

1.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院 屈光手術中心，浙江 溫州 325027；2.義烏市婦幼保健院 五官科，浙江 金華 322000

圓錐角膜（keratoconus，KC）是一種多因素病因的雙側角膜變薄性疾病，以進行性角膜變薄變陡，不規(guī)則散光，視力下降，角膜前突為主要表現[1]。已有研究表明，遺傳因素在KC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2]。雖然多年來，KC的眾多候選基因已被確定，但這些孤立的基因尚不能解釋疾病的復雜機制[3]。 目前，微陣列分析作為在基因組水平上獲得基因表達數據的一種有前景的工具，已被廣泛應用于疾病的分子發(fā)生和發(fā)展研究中[4]。隨著生物信息學技術的發(fā)展，基于網絡的方法使疾病機制的研究更加深入。SHARIF等[5]利用蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網絡分析鑒定了EGFR、NEDD4、SNTA1、LGALS3BP、HSPB1、SDC2、Mme和HIF1a等多種網絡節(jié)點，這些節(jié)點被稱為關鍵（Hub）基因（蛋白質），在維持網絡結構和提供生物系統的關鍵信息方面起著關鍵作用[6-8]。本研究在網絡分析的基礎上[9]，進一步使用ClueGO使基因矩陣中最重要的條目在網絡中可視化，為觀察他們之間的相互關系提供了更加深入的視角，同時從分子水平上進一步了解KC的發(fā)生發(fā)展，并探索了診斷、預后和藥物靶點的潛在候選的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 微陣列分析數據 從GEO數據庫下載GSE77938基因表達譜。GSE77938基于Affymetrix GPL18460 平臺（Affymetrix Human，Illumina HiSeq 1500），由 KABZA等[10]提交。GSE77938數據集包含50個樣本，其中有25個KC樣本和25個正常對照樣本（下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77938）。

1.2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的數據預處理與鑒定 用R語言（v.3.3.2）對原始微陣列數據進行預處理?；谄脚_ 上的注釋信息，將探針I(yè)Ds轉換成相應的基因名。當 多個探針對應于同一基因時，計算平均表達值來表示基因表達水平。樣本分為KC組和對照組。然后，采用線性模型進行微陣列分析（Bioconductor的limma包）以識別DEGs。以|log2fold change（FC）| ＞0.992并且P＜0.05作為DEGs的臨界值。

1.3 DEGs的功能富集分析 基因本體論（GO，http://www.geneontology.org/）是一種常用的對基因和基因產物進行注釋和識別特征生物的方法。京都基因和基因組百科全書（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/Pathway.html）通路富集分析是一個包含生物化學通路的生物信息學數據庫。注釋、可視化和集成發(fā)現的數據庫（DAVID，http://david.abcc.Ncifcrf.gov/）在線軟件，是從大量基因中提取生物意義的分析工具。DAVID分別用于上調和下調DEGs的GO富集和KEGG通路富集分析。具有顯著差異的功能和通路的臨界值為P＜0.05，計數（在特定功能或途徑項中富集的基因數）＞2。

1.4 PPI網絡的構建及子網絡分析 檢索相互作用基因的搜索工具（STRINGv-10.0，http://stringdb.org/）數據庫是用來評估PPI信息的在線工具。為了評價DEGs之間的相互作用關系，將DEGs映射到STRING上，并從蛋白質水平篩選DEGs之間的相互作用關系。然后，在聯合評分＞0.4 的條件下，分別構建了上調和下調DEGs的PPI網絡。然后，利用 Cytoscape軟件構建PPI網絡。采用插入式分子復合物檢測技術（MCODE）對Cytoscape中PPI網絡的子網絡進行了篩選。選擇閾值節(jié)點密度截斷值為1、節(jié)點得分截斷值為0.2、k核為3、最大深度為100的聚類進行進一步分析。采用ClueGO插件對Hub基因列表進行可視化GO和KEGG分析。

2 結果

2.1 DEGs的鑒定 分析的樣本為25個KC樣本和25個正常樣本。根據篩選標準，KC患者角膜共鑒定出1 547個DEGs，其中上調基因1 103個，下調基因444個（見圖1）。

圖1 DEGs的火山圖

2.2 GO富集分析 上調和下調表達基因富集的前5個GO項見圖2。GO分析結果表明，上調的DEGs在生物過程（biological process，BP，1 220）、分子功能（molecular function，MF，102）和細胞成分 （cell composition，CC，102）中均顯著富集。在BP中，這些基因顯著參與免疫應答（P＜0.001）、免疫系統過程（P＜0.001）和防御應答（P＜0.001）。MF和CC的最顯著項分別是抗原結合（P＜0.001）和質膜（P＜0.001），而下調的DEGs在BP（99）、MF（47）和CC（64）中也有富集。BP、MF和CC的最顯著富集項分別為感知覺（P＜0.001）、門控通道活性（P＜0.001）和膜內成分（P＜0.001）。

2.3 KEGG通路分析 上調和下調基因的KEGG通路見圖3。上調的DEGs在72條通路中顯著富集，其中前5個最具有顯著差異的通路分別為細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號途徑、移植物排斥反應、類風濕關節(jié)炎和移植物抗宿主病。而下調的DEGs在8條通路中顯著富集，其中富集最顯著的前5條通路為味覺傳導、cAMP信號途徑、谷氨酸突觸、5-羥色胺能突觸和2型糖尿病。

圖2 KC相關DEGs的前5位GO功能富集分析

2.4 PPI網絡和子網絡 基于STRING數據庫的信息，分別構建了上調和下調DEGs的PPI網絡。在上調DEGs的PPI網絡中，共有602個節(jié)點和9 903個相互作用，識別出三個聚類（見圖4）。Hub基因（度＞150）為TNF（235）、JUN（231）、IFNG（216）、PTPRC （197）、ICAM1（194）、FOS（193）、IL6（192）、CXCL8 （178）、LCK（165）、CSF2（163）、MMP9（162）、ITGAX （152）、CD40LG（152）和IL10（151），對于下調的DEGs，共有143個節(jié)點和319個相互作用（見圖5）（度＞150）。

圖3 KC相關DEGs的前5位KEGG通路分析

2.5 Hub基因的ClueGO分析 通過ClueGO分析，將Hub基因和通路網絡進行可視化展示。結果表明，這些Hub基因顯著富集在6個GO項中（見圖6）。最顯著的是骨髓白細胞分化的陽性調節(jié)（P ＜0.01）、STAT蛋白酪氨酸磷酸化的陽性調節(jié)（P＜0.01）、平滑肌細胞增殖（P＜0.01）、平滑肌細胞增殖的調節(jié) （P＜0.01）、細胞對脂多糖的反應（P＜0.01）以及趨化因子生物合成過程的調節(jié)（P＜0.01）。而Hub基因的KEGG途徑在3個通路顯著富集（見圖7）。最顯著的是NF-κB信號通路（P＜0.01）、原發(fā)性免疫 缺陷（P＜0.01）和T細胞受體信號通路（P＜0.01）。

圖5 PPI網絡用于表示下調表達的DEGs

3 討論

KC是一種異質性退行性疾病。其病因和潛在的病理機制尚不清楚，但環(huán)境和遺傳因素都被認為是導致該疾病發(fā)展的相關因素[11-12]。最近，12項不同的KC研究已經確定了至少17個基因座，表明KC可能是由不同家族的許多不同基因突變引起的[13]，因此了解KC的分子機制和關鍵基因對于診斷和治療具有重要意義。本研究從GSE77938中提取數據，利用生物信息學分析鑒定KC和正常對照之間1 103個上調和444個下調的DEGs。為了更好地理解DEGs的相互作用進一步進行了GO功能富集分析、KEGG通路分析和PPI網絡分析。通過構建PPI并應用MCODE和ClueGO插件發(fā)現了一些Hub基因和關鍵通路，為KC的治療研究提供了新的思路。

構建了上調和下調DEGs的PPI網絡后，發(fā)現最高度的基因（度＞20）均處于上調DEGs中，充分提示上調的DEGs具有KC的生物活性。GO分析表明，上調的DEGs在BP方面主要參與免疫應答、免疫系統過程和防御應答的調控等過程。MF和CC主要表現在抗原結合、受體結合、細胞因子活性和質膜、細胞外周，這些結果表明，該病的病因與免疫反應可能存在根本的聯系或相關性。而過去研究發(fā)現KC患者血清免疫球蛋白E水平較高，免疫穩(wěn)態(tài)受到損害等表現也從側面確認了變態(tài)反應和KC之間的聯系 性[14-16]。此外，上調DEGs富集的KEGG通路主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號途徑，這與角膜上皮細胞和基質細胞能夠合成趨化因子、細胞因子及其受體，以及這些分子在角膜傷口愈合和炎癥反應中能夠發(fā)揮作用的認識是一致的[17]。WHEATER等[18]報道在其他類型的角膜疾病中，如大皰性角膜病變，這些通路也發(fā)生了變化。

通過用上調的DEGs構建PPI網絡，并應用MCODE和ClueGO，發(fā)現了幾個重要的通路（骨髓白細胞分化的陽性調節(jié)，STAT蛋白酪氨酸磷酸化的陽性調節(jié)，平滑肌細胞增殖，平滑肌細胞增殖的調節(jié)，細胞對脂多糖的反應、趨化因子生物合成過程的調控、NF-κB 信號通路、原發(fā)性免疫缺陷和T細胞受體信號通路）和14個Hub基因，這些通路和基因可能是診斷KC的有效途徑。

本研究相比KABZA等[10]的研究最大的不同也是本研究的主要創(chuàng)新點在于，本研究不僅僅分析了基因的表達差異，同時結合了GO進行數據分析（KABZA等[10]的研究并未使用GO分析方法），且發(fā)現了關聯基因TNF、JUN、IFNG、PTPRC、ICAM1、FOS、IL6、CXCL8、LCK、CSF2、MMP9、ITGAX、CD40LG和IL10。在這些發(fā)現的與KC相關聯的基因中，TNF、IFNG、PTPRC、ICAM1、FOS、CXCL8、LCK、CSF2，ITGAX基因之前未見報道。

本研究中，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因在網絡中顯示出最高的度（232）。TNF作為一種主調節(jié)因子在平衡細胞存活、凋亡和壞死中的作用已經在各種細胞類型和組織中被廣泛研究[19]。有研究發(fā)現單側KC患者和對側有亞臨床疾病的患者，雙眼IL-6和TNF-α水平均升高，但TNF-α只在KC眼中顯著升高[20]。CHEUNG等[21]發(fā)現，TNF-α能夠觸發(fā)角膜細胞凋亡，以及增加膠原蛋白的更新率。此外，POULIQUEN等[22]認為TNF-α可能調節(jié)一個涉及纖溶酶系統的蛋白酶級聯反應，最終導致KC細胞外基質的變化。

據報道，PPI網絡中的IL6、MMP9、IL10等基因在KC患者以及角膜下壁變薄病例（類似KC）的淚液中也有明顯升高。這是一個非常有力的證據，同樣支持角膜變薄和擴張與涉及炎癥事件的細胞外基質降解有關（主要是MMP-9、IL-6和TNF-α水平升 高）[23-24]。

本研究在KC中獲得了一些重要的基因和通路，但還存在一些局限性：基于生物信息學方法進行探究，結論尚未得到生物學實驗的證實；研究樣本量有限。進一步探討KC的分子機制，并將分子遺傳學診斷應用于臨床，有待進一步地探索[25]。

綜上所述，本研究提出了幾個與KC相關的Hub基因，系統地介紹了與之相關的生物過程和信號傳導通路，這些基因很少有被證實，但其中有許多被報道與KC有關。這些基因可作為KC治療的分子靶點和診斷性生物標志物，應引起更多的研究關注。通過生物信息學分析揭示這些基因有可能與KC的病理機制相關，后續(xù)的研究需要利用細胞實驗和動物實驗進行深入的驗證，為尋找新的靶點藥物奠定關鍵的科學基礎。

圖7 上調DEGs中Hub基因的ClueGO分析