吳賢敏，張杰，楊子飛，葉凡，張悅，陳曉云

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 溫州 325015

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部鱗狀上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，因其解剖位置隱蔽和癥狀非特異性等特點(diǎn)，70%～80%的NPC患者往往出現(xiàn)局部晚期癥狀時(shí)才得以確診[1]。目前，NPC的主要治療手段主要包括早期放療和晚期放化療。然而，放療會(huì)引起許多并發(fā)癥，例如前庭功能障礙，放射誘發(fā)的視振蕩，感覺(jué)神經(jīng)性聽力下降，滲出性中耳炎（otitis media exudative，OME）和顳骨放射性骨壞死（osteoradionecrosis，ORN），甚至是危及生命的大出血[1-2]。一些化療藥物（如順鉑）對(duì)NPC患者的療效已經(jīng)得到證實(shí)，但其耳毒性等不良反應(yīng)限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用[3]。因此，尋找新型低毒高效的藥物對(duì)于治療NPC具有重要意義。

α-茄堿是一種三糖糖苷生物堿，主要存在于馬鈴薯塊莖和茄屬植物中[4-6]。近年來(lái)，關(guān)于α-茄堿對(duì)各種人類癌細(xì)胞株的體內(nèi)、外抗增殖活性的研究均有報(bào)道[7-11]，然而，其潛在的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未被完全闡明。本研究探究了α-茄堿在體外對(duì)NPC CNE-2細(xì)胞的抑制作用，旨在闡明α-茄堿對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其具體細(xì)胞分子機(jī)制，以期為NPC的治療提供新思路，為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。α-茄堿和青霉素G購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒、RIPA裂解緩沖液及TRIzol試劑均購(gòu)自北京Protein Biotechnology 公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；Mito-SOX試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ECL顯色液購(gòu)自美國(guó) Abcam公司；一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche Life Science公司；戊二醛、鋨酸及乙酸鈾酰均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丙酮購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)氧樹脂購(gòu)自英國(guó)TAAB公司；枸櫞酸鉛購(gòu)自美國(guó)Polysciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將CNE-2細(xì)胞系維持在RPMI-1640培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清以及100 kU/L 的青霉素G），置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。

1.2.2 給藥處理：制備CNE-2細(xì)胞懸液，接種于96孔板或6孔板中，放置在37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)。按0、5、10、15 μmol/L的濃度梯度，計(jì)算用量后將α-茄堿分別加入含RPMI-1640培養(yǎng)基的離心管中混勻。棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入含不同濃度（0、5、10、15 μmol/L）α-茄堿的培養(yǎng)基，作用一段時(shí)間（12、24、48 h）后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2 細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中。24 h 后，用不同濃度的α-茄堿（0、5、10和15 μmol/L） 作用CNE-2細(xì)胞。經(jīng)過(guò)不同的作用時(shí)間（12、24、 48 h）后，加入CCK-8試劑，避光孵育2 h后在酶標(biāo)儀 上檢測(cè)各孔OD值。根據(jù)結(jié)果選擇出適宜作用時(shí)間。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和ROS水平變化：用不同濃度（0、5、10、15 μmol/L）的α-茄堿作 用CNE-2細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，離 心5 min收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞2次，并以1×106個(gè)/mL的濃度重懸于1×結(jié)合緩沖液中，與ANXA5-FITC和碘化丙啶輕輕混勻，在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下避光孵育30 min后，立即使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。使用Mito-SOX試劑盒檢測(cè)ROS水平。用不同濃度的α-茄堿（0、5、10、15 μmol/L）處理細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化，并離心5 min。隨后將細(xì)胞重懸于含有Mito-SOX的溶液中10 min，用PBS輕柔洗滌2次，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：將CNE-2細(xì)胞裂解后，通過(guò)BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒 測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離樣品，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫封閉緩沖液封閉膜1 h，然后與稀釋后的一抗在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。將膜在TBST中洗滌3次，然后在與HRP偶聯(lián)的二抗溶液中（1:5 000配制）孵育1 h，再用TBST洗滌3次，用ECL顯色液顯色。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)：用TRIzol試劑提取CNE-2細(xì)胞的總RNA，并使用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒，在Applied Biosystems CFX96 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。所有設(shè)計(jì)的靶向mRNA的引物均經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。 qRT-PCR的條件如下：95 ℃預(yù)變性15 s，1個(gè)循環(huán)；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。用GAPDH對(duì)每種mRNA表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.7 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：收集CNE-2細(xì)胞，2.5%戊二醛中固定24 h，1%鋨酸中固定1～2 h。丙酮脫水，包埋在環(huán)氧樹脂中。超薄切片用檸檬酸鉛和乙酸鈾酰染色，用蒸餾水輕輕洗滌，最后在JEM 1230 TEM上進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用Microsoft Excel和GraphPad Prism6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Dunnett多重檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 α-茄堿對(duì)CNE-2細(xì)胞存活的影響

2.1 α-茄堿顯著抑制CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 經(jīng)不同的加藥時(shí)間（12、24、48 h）以及不同濃度的α-茄堿（0、5、10、15 μmol/L）處理后，隨著藥物濃度和加藥時(shí)間的增加，存活細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P ＜0.01）。當(dāng)用5 μmol/L α-茄堿處理細(xì)胞12 h或24 h時(shí)，活細(xì)胞的比例與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。α-茄堿作用48 h對(duì)CNE-2細(xì)胞的抑制作用處于一個(gè)較為適宜的水平，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也作用48 h。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度增加時(shí)，凋亡和死亡的CNE-2細(xì)胞的比例均顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

2.2 α-茄堿增加CNE-2細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生 采用Mito-SOX Red線粒體超氧化物熒光探針（一種氧化還原熒光基團(tuán)，可選擇性檢測(cè)線粒體超氧化物）檢測(cè)α-茄堿處理48 h后CNE-2細(xì)胞中線粒體ROS水平。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比，當(dāng)α-茄堿濃度增加時(shí)，線粒體ROS水平顯著升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 α-茄堿作用后CNE-2細(xì)胞中ROS水平的變化

2.3 α-茄堿在CNE-2細(xì)胞中引起線粒體損傷 TEM顯示CNE-2細(xì)胞線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體嚴(yán)重腫脹和線粒體嵴網(wǎng)絡(luò)消失。正常細(xì)胞線粒體形態(tài)正 常，線粒體嵴豐富而清晰。我們還觀察到，升高濃度的α-茄堿增加了功能障礙的線粒體的數(shù)量，同時(shí)減少了CNE-2細(xì)胞中自噬體的數(shù)量（見圖3）。

2.4 α-茄堿影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平 10 μmol/L α-茄堿處理48 h后，CNE-2細(xì)胞中Aif（凋亡誘導(dǎo)因子）和Caspase-8的mRNA表達(dá)與對(duì)照相比明顯增加 （P＜0.01）；FADD（Fas相關(guān)死亡域蛋白）的表達(dá)也增加，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。α-茄堿處理后Bcl-2 表達(dá)量顯著下降，盡管Bax的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，但Bcl-2/Bax比值顯著降低 （P＜0.05）。蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示α-茄堿作用48 h后，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），這與qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。見圖4。

3 討論

圖3 α-茄堿作用后CNE-2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化（紅色三角形為腫脹線粒體，黃色三角形為自噬體）

圖4 不同濃度α-茄堿作用于CNE-2細(xì)胞48 h后凋亡相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化

NPC是一種頭頸部惡性腫瘤，具有明顯的地區(qū)和種族分布特征，在東亞和東南亞尤為常見。遺傳、種族、環(huán)境、飲食、EB病毒感染等因素均與NPC的發(fā)病相關(guān)[12]。目前，放射治療是NPC的主要治療方法。隨著影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，調(diào)強(qiáng)放射治療的出現(xiàn)以及同步放化療在晚期腫瘤患者中的應(yīng)用，NPC患者的生存率得到了顯著提高，并發(fā)癥相較以往也明顯減輕[13]。然而，放療仍會(huì)不可避免地?fù)p傷從顱底到頸部的受輻射區(qū)域的腫瘤相鄰組織，進(jìn)而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，例如吞咽困難、聽力下降、口干癥，以及中耳炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療的依從性，有時(shí)甚至?xí)鹞＜吧拇蟪鲅猍12-14]。因 此，開發(fā)特異和有效地靶向癌細(xì)胞的新型治療藥物具有重要的臨床意義。α-茄堿是茄屬植物中的主要糖苷生物堿，體外實(shí)驗(yàn)[15-18]及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[9-10]均證實(shí)其具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。然而，目前α-茄堿對(duì)NPC的作用報(bào)道甚少，作用機(jī)制亦不明確。

細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要途徑，可被多種細(xì)胞信號(hào)激活，其中氧化損傷引起的羥自由基等ROS是眾多因素中至關(guān)重要的一種，ROS的生成增多能夠增加細(xì)胞凋亡。線粒體途徑作為細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的主要通路，由多種凋亡蛋白及抗凋亡蛋白調(diào)節(jié)，其中促凋亡蛋白Bax可以改變線粒體膜的通透性并促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。與此相反，具有抗凋亡功能的Bcl-2 家族蛋白可以調(diào)節(jié)線粒體凋亡因子（如細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子）的釋放。當(dāng)Bcl-2蛋白家族與Bax蛋白結(jié)合時(shí)，可以阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程。Bcl-2 和Bax之間的比例失衡將導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-9的激活，進(jìn)一步激活下游Caspase-3形成裂解的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19-20]。已有研究報(bào)道α-茄堿通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。有學(xué)者將α-茄堿用于食管惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)α-茄堿能夠降低該細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 的表達(dá)，增加Bax表達(dá)并增加Caspase-3/7的活性[21]。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞上α-茄堿可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比例并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。本研究通過(guò)Mito-SOX的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，α-茄堿顯著增加了線粒體ROS的生成水平，表明α-茄堿的抗腫瘤機(jī)制具有ROS依賴性；同時(shí)我們觀察到Bcl-2/Bax比值的降低，Aif表達(dá)的增加以及線粒體的改變，表明α-茄堿在CNE-2細(xì)胞中誘導(dǎo)了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果與先前的研究基本一致。然而，LEE等[22]在結(jié)腸癌細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)α-茄堿會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和Caspase-3的激活，但通過(guò)不依賴于ROS的線粒體凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞死亡。雖然這與我們以及之前的研究有所區(qū)別，但α-茄堿可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以得到證實(shí)，可能在不同腫瘤細(xì)胞上存在生物學(xué)差異性。

FADD（Fas相關(guān)死亡域蛋白）是細(xì)胞外源性凋亡途徑的一個(gè)重要因子，能促進(jìn)Caspase-8的活化，誘導(dǎo)死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。我們的數(shù)據(jù)表明，α-茄堿可增加CNE-2細(xì)胞中的FADD和Caspase-8的表達(dá)，這也提示α-茄堿可以通過(guò)Fas介導(dǎo)CNE-2細(xì)胞外源性凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)α-茄堿能引起CNE-2線粒體內(nèi)ROS升高，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷，最終引起細(xì)胞凋亡，而且其抗腫瘤效應(yīng)隨著藥物濃度增加而增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性。α-茄堿通過(guò)線粒體途徑和Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?茄堿在體外對(duì)CNE-2細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制作用，可以作為NPC治療的一種潛在的候選藥物。