李利義，涂富洋，尤孫武，沈雷斌，游濤，鄭志強(qiáng)

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325000

截至2016年，全球有近120萬胃癌突發(fā)病例，發(fā)病率增加了15%[1]。化療及手術(shù)治療仍是當(dāng)前對多數(shù)進(jìn)展期胃癌的首要治療方式，盡管取得了進(jìn)展，但胃癌的長期存活率仍不能令人滿意。表皮生長因子樣蛋白（epidermal growth factor like，EGFL）家族含多個重復(fù)表皮生長因子表達(dá)，并通過與其受體結(jié)合觸發(fā)多種生物學(xué)功能，如血管生成、增殖、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、遷移和侵襲[2]。EGFL7已被證明在癌癥發(fā)生發(fā)展中起作用[3]。EGFL6作為一種分泌蛋白，其結(jié)構(gòu)同源性位于人Xp22染色體上[4]。 EGFL6能通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并在基質(zhì)血管細(xì)胞的黏附和增殖中起到作用[5]。EGFL6的表達(dá)改變已在多種癌癥中被檢測到，如卵巢癌[6]、結(jié)腸癌[7]等；但EGFL6在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用知之甚少。本研究的目的旨在探究EGFL6在胃癌患者中的表達(dá)和作用，探討EGFL6表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年3月至2018年2月間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院接受胃癌根治手術(shù)切除的原發(fā)性胃癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）各80例，其中男50例，女30例，年齡（62±11）歲；所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)證實，且均未接受放療或化療。所有患者均接受標(biāo)準(zhǔn)的胃癌根治術(shù)，術(shù)后治療統(tǒng)一按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)胃癌臨床實踐指南執(zhí)行。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 通過DAB染色法檢測EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)。石蠟包埋的胃癌組織切片在二甲苯中脫蠟、水化，用3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min后，進(jìn)行抗原熱修復(fù)。用10%的山羊血清進(jìn)行抗原封閉，后滴加純化的單克隆兔抗人EGFL6抗體（稀釋度1:100，英國Abcam公司）作為一抗處理胃癌切片。在4 ℃下pH 7.4中孵育16 h，37 ℃下復(fù)溫30 min。滴加酶標(biāo)山羊抗兔二抗在室溫中孵育30 min，DAB顯色試劑顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替I抗，作為陰性對照。癌旁組織也按照上述方法進(jìn)行操作。結(jié)果判定：在胃癌及癌旁組織切片中EGFL6陽性表達(dá)的細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染為棕黃色。判定標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲法計數(shù)10個高倍視野，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時忽略較弱或可疑的染色。

1.3 隨訪 由病理學(xué)專家組根據(jù)第8版TNM分期系統(tǒng)對臨床和組織學(xué)分類進(jìn)行分組。對所有術(shù)后患者每3至6個月通過信函或電話進(jìn)行隨訪，隨訪時間為3年，最后1次隨訪時間為2020年9月30日。在前3年內(nèi)每3至6個月進(jìn)行胃鏡、腹部CT或增強(qiáng)CT掃描評估疾病狀態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，生存曲線用Kaplan-Meier法比較，生存率比較用Log-rank檢驗，預(yù)后影響因素用COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行評估。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFL6在胃癌組織中的表達(dá) EGFL6在胃癌組織中主要表達(dá)于腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，陽性表達(dá)呈黃棕色顆粒，在鄰近癌旁組織中EGFL6呈陰性或弱陽性表達(dá)，見圖1-2。

圖1 胃癌組織EGFL6陽性表達(dá)（DAB染色，×100）

圖2 鄰近癌旁組織EGFL6陰性表達(dá)（DAB染色，×100）

2.2 EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)差異 在80例胃癌組織中，陽性表達(dá)者有54例（67.5%）；在80例對應(yīng)癌旁組織中，陽性表達(dá)者有11例（13.75%），胃癌組織中EGFL6 的表達(dá)顯著高于鄰近癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=47.909，P＜0.01）。

2.3 EGFL6表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系 EGFL6 表達(dá)與胃癌患者腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），見表1。EGFL6蛋白的表達(dá)、年齡、腫瘤直徑、細(xì)胞分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.4 EGFL6與胃癌預(yù)后的關(guān)系 EGFL6陰性表達(dá)患者的3年中位無病生存率（88.5%）較陽性表達(dá)患者（64.8%）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。COX回歸模型分析顯示，年齡、腫瘤直徑、細(xì)胞分化程度是影響胃癌術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表3。

3 討論

EGFL6可以在體內(nèi)外促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖。據(jù)已有研究數(shù)據(jù)顯示，EGFL6在內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成中起到作用，并促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。部分表皮生長因子家族蛋白，如人肝素結(jié)合性表皮生長因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）已被證明在細(xì)胞癌變的過程中發(fā)揮重要作用[9]，并且能作為癌癥的預(yù)后指 標(biāo)[10]。有研究報道EGFL6參與了人類癌癥的進(jìn)展[2]，如卵巢癌[6]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等，并且EGFL6已被證明是卵巢癌患者生存率低的預(yù)測因子[6]。

表1 EGFL6表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系（例）

本研究表明了EGFL6與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。EGFL6蛋白的表達(dá)、患者的年齡、腫瘤直徑、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均與胃癌術(shù)后患者的預(yù)后相關(guān)，提示EGFL6的高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的重要分子標(biāo)志。但EGFL6的表達(dá)程度與腫瘤的分化程度及腹膜轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。且COX多因素生存分析提示EGFL6的表達(dá)并非胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，究其原因可能與樣本容量不足以及胃癌的早期發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)，需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量驗證。

表2 80例胃癌患者臨床病理因素與預(yù)后的關(guān)系（例）

圖3 EGFL6陽性表達(dá)與陰性表達(dá)胃癌患者的生存曲線

關(guān)于EGFL6在癌癥中的作用機(jī)制，ZHANG等[13]指出EGFL6可以通過調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)β-catenin及其下游蛋白CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長，在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。PI3K/AKT通路已被確定是參與腫瘤細(xì)胞凋亡的重量信號通路之一，其通路的激活能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和進(jìn)展，ZHU等[14]研究發(fā)現(xiàn)AKT的磷酸化受細(xì)胞內(nèi)EGFL6水平的影響，并呈現(xiàn)正相關(guān)，在鼻咽癌細(xì)胞中沉默EGFL6時AKT信號通路受到抑制從而表現(xiàn)出腫瘤生長的停滯，表明EGFL6可以通過激活A(yù)KT通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移。EGFL6的表達(dá)可以使上皮間質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，此過程參與了腫瘤的發(fā)生，通過增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲和抗凋亡能力，使腫瘤細(xì)胞惡性程度增高，賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性。但EGFL6在胃癌中的作用機(jī)制目前鮮有研究，本研究表明EGFL6與胃癌的部分臨床病理因素具有相關(guān)性，下一步將采用抗EGFL6的單克隆抗體阻斷EGFL6表達(dá)以控制胃癌細(xì)胞的增殖，深入研究EFGL6在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制及相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)的影響，為利用EGFL6的生物學(xué)特性設(shè)計靶向藥物治療胃癌提供有價值的實驗基礎(chǔ)。

表3 胃癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析結(jié)果

本研究顯示EGFL6的表達(dá)在臨床分析中與胃癌患者存在相關(guān)性，提示EGFL6在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。EGFL6的檢測有望成為胃癌分子診斷和病期評估的標(biāo)志之一，為胃癌的治療提供一個新的分子靶標(biāo)。