陳瑤，楊訓(xùn)俊，陳涵斌，陳國(guó)榮

1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325027

肝癌是所有癌癥中病死率排第二的惡性腫瘤，占全世界癌癥發(fā)生率的6%，在肝癌中，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占85%～90%[1-2]。 肝癌的全球分布不均勻，由于HBV和HCV的高流行，超過50%的HCC病例發(fā)生在撒哈拉以南非洲和東亞，美國(guó)和北歐是HCC發(fā)病率較低的地區(qū)，但近年來有所上升[3]。肝癌的危險(xiǎn)因素主要包括肝炎病毒感染、黃曲霉毒素暴露、酗酒和非酒精性脂肪肝。在這些因素中，非酒精性脂肪肝被認(rèn)為是肝癌發(fā)病率逐年增加的關(guān)鍵因素之一，這也讓越來越多的研究者關(guān)注脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)在肝病甚至HCC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用[4]。

甾醇O-?；D(zhuǎn)移酶（sterol O-acyltransferase， SOAT）是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白，可將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，已被認(rèn)為是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要因素，SOAT參與膽固醇酯的儲(chǔ)存、膽固醇的自由吸收、脂蛋白的合成[5-6]。SOAT包含SOAT1和SOAT2兩種酶，但是這兩種酶之間的差異仍然存在爭(zhēng)議。部分研究表明，在成年肝臟中，SOAT1是主要的酶，其表達(dá)水平高于SOAT2，并且在膽固醇穩(wěn)態(tài)中起著更重要的作用[7-8]。有研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，鑒定出SOAT1在肝癌的早期發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵作 用[9]。事實(shí)證明，SOAT1不僅是體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要酶，同時(shí)在肝癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，具備成為肝癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志物的潛力。

在我國(guó)HBV相關(guān)性肝癌占絕大部分，但目前關(guān)于SOAT1蛋白在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)和臨床相關(guān)性報(bào)道卻很少。本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于SOAT1在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，探討SOAT1 mRNA水平與腫瘤的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。同時(shí)，通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SOAT1蛋白質(zhì)水平在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)情況，初步探討其臨床病理意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2018年5月至2019年10月期間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科診斷為HCC的患者53例，獲取患者癌及癌旁石蠟組織，追蹤記錄所有患者詳細(xì)臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為HCC；②手術(shù)前未接受化療或放射治療；③有詳細(xì)住院資料；④有HCV感染史或表面抗原檢測(cè)陽(yáng)性；⑤自愿參與本次研究的溫州人或在溫州生活5年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有基礎(chǔ)代謝 性、感染性疾??；②有其他腫瘤病史；③曾接受過放化療；④無法獲取完整臨床資料；⑤非溫州地區(qū)人群。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受檢者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 SOAT1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（ab39327），PV-8000通用型免疫組織化學(xué)二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。每個(gè)標(biāo)本收集癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組 織，連續(xù)切片，厚度為4 μm，置于防脫落載玻片上，烘干后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 上述白切片經(jīng)常規(guī)烤片、脫蠟和水化后，0.3% H2O2避光孵育10 min以修復(fù)抗原，PBS沖洗3遍，每遍5 min；高壓抗原修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3遍，每遍5 min；滴加SOAT1 抗體（1:400稀釋），4 ℃孵育過夜。次日37 ℃復(fù)溫30 min，PBS沖洗滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3遍，每遍5 min；在每張切片上滴加100 mL現(xiàn)配DAB顯色劑，室溫下避光顯色，3～5 min后蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精對(duì)比染色1 min，自來水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察切片，進(jìn)行評(píng)估。

1.4 結(jié)果判定 所有結(jié)果均由2位病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，以保證結(jié)果的可重復(fù)性。SOAT1為細(xì)胞漿著色，評(píng)分采用著色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞比例相結(jié)合的方法，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和陽(yáng)性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)相乘得到染色分?jǐn)?shù)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：＜7分為低表達(dá)組，≥7分為高表達(dá)組[10]。

1.5 生物信息學(xué)分析 收集TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)374例HCC組織及50例正常對(duì)照肝組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，比較兩種組織中SOAT1表達(dá)量的差別。同時(shí)，根據(jù)RNAseq數(shù)據(jù)，以表達(dá)量的中位數(shù)為界將肝細(xì)胞癌分為高表達(dá)與低表達(dá)2組，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，總生存時(shí)間從疾病診斷開始計(jì)算至患者死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，2組間比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)；采用Kaplan-Meier法與Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果 通過Starbase3.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取并分析來源TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的374例HCC癌組織和50例正常對(duì)照肝組織。比較2組中SOAT1 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示SOAT1 mRNA在癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常肝組織（P＜0.01）；生存曲線結(jié)果顯示低表組5年生存率更高（P＜0.05），但10年生存率兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.140），見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SOAT1表達(dá)量及生存曲線分析

2.2 SOAT1在HCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)采用人工半定量分析法，結(jié)果顯示肝癌組織中SOAT1有22例高表達(dá)，31例低表達(dá)；而在癌旁正常肝組織中有8 例高表達(dá)，30 例低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）。SOAT1在癌組織中的蛋白表達(dá)量也顯著高于癌旁正常肝組織（6.415± 3.433 vs. 4.413±2.341，P＜0.01），見圖2。

圖2 SOAT1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.3 HCC組織中SOAT1蛋白表達(dá)量與臨床病理相關(guān)性 結(jié)果顯示SOAT1表達(dá)水平與肝癌臨床分期呈正相關(guān)（r=0.320，P=0.021），并且發(fā)現(xiàn)SOAT1高表達(dá)組中更易見微血管癌栓（P=0.013），表明SOAT1與腫瘤血管侵襲相關(guān)。但該蛋白表達(dá)與年齡、性別、BMI、腫瘤大小、腫瘤分化程度、肝功能和血脂含量等指標(biāo)無明顯相關(guān)性。具體見表1。

3 討論

肝癌為發(fā)病率和病死率都極高的惡性腫瘤。近年來從發(fā)病危險(xiǎn)因素分析到早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物的尋找，再到放化療耐藥機(jī)制的探討，以及靶向藥物的研發(fā)都在世界各中心和研究所中進(jìn)行相應(yīng)的研究，并且取得了一些可觀的進(jìn)展[11-13]。肝癌的早期診斷敏感性和特異性有所提高，治療的5年生存率也有一定程度的提高，但仍然只有17%左右。

HCC作為肝癌中最主要的類型，是肝癌研究的重點(diǎn)。HCC的發(fā)生發(fā)展主要由復(fù)雜的遺傳因素[14-15]（遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素、基因變異等）和環(huán)境因素[16-17]協(xié)同作用，共同促進(jìn)肝炎-肝硬化-肝癌的轉(zhuǎn)變效應(yīng)。當(dāng)前晚期肝癌的治療手段有限，效果不佳，且花費(fèi)巨大，因此尋找早期診斷或與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，是有效改善肝癌患者診療的途徑，也是當(dāng)前研究肝癌的重點(diǎn)方向。

表1 SOAT1不同表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析

國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，鑒定出了在HCC早期發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白SOAT1，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。SOAT1在將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯并將其儲(chǔ)存在脂滴中的過程中發(fā)揮了一定作用，是血管粥樣硬化和冠心病的危險(xiǎn)因素[18-20]。 此前已有研究報(bào)道該蛋白在惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，具有作為多種癌癥治療靶點(diǎn)的潛力[21-24]。本研究通過生物信息學(xué)方法，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)證實(shí)HCC組織中SOAT1 在轉(zhuǎn)錄水平上同樣表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)，并且發(fā)現(xiàn)SOAT1 高表達(dá)的患者預(yù)后比低表達(dá)的患者差。mRNA水平的結(jié)果證實(shí)了SOAT1在HCC發(fā)生發(fā)展中具有一定作用，這與前期蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果相符。此外，本研究通過免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)HCC組織和配對(duì)癌旁組織中SOAT1的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)SOAT1在肝癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織，這結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相一致。通過比較SOAT1表達(dá)量不同的HCC患者資料，發(fā)現(xiàn)該蛋白高表達(dá)患者TNM臨床分期更偏中晚期，且更易見與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的微血管癌栓。我們推測(cè)SOAT1在腫瘤發(fā)展過程中具有累積效應(yīng)，說明可能在HCC發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，而更易見微血管癌栓則能說明SOTA1可能參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。基于以上發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)SOAT1通過促進(jìn)膽固醇脂的合成，進(jìn)而增加了細(xì)胞膜上與癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移相關(guān)的膽固醇脂類受體，從而在促進(jìn)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。此外，SOAT1表達(dá)量與腫瘤大小和腫瘤分化程度無關(guān)，且不影響肝功能、AFP、血脂等指標(biāo)。提示SOAT1在HCC中的作用可能較為局限，值得進(jìn)一步多中心、大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)SOAT1在HCC中表達(dá)顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)SOAT1高表達(dá)與腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移傾向相關(guān)，表明其可能作為判斷HCC患者病情進(jìn)展及預(yù)后的依據(jù)之一，有望成為肝癌診斷、預(yù)后及療效判斷的分子標(biāo)志物。但是本研究還存在不足之 處，其一，本次納入的樣本量較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；其二，未收集正常患者肝組織標(biāo)本，無法證實(shí)肝癌患者正常肝組織是否已經(jīng)發(fā)生SOAT1表達(dá)量增高的情況；其三，本研究主要通過臨床數(shù)據(jù)揭示SOAT1與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，并未涉及具體功能機(jī)制，這值得進(jìn)一步深入研究。