周麗麗，溫鄭靜，徐晨陽，李煥錚，徐雪琴，唐少華

溫州市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000

頸項(xiàng)透明層（nuchal translucency，NT）厚度是指胎兒頸椎水平矢狀切面皮膚至皮下軟組織之間的最大厚度，反映了胎兒頸后皮下淋巴液的積聚程度，是孕早期（11～13+6周）篩查胎兒染色體異常的最佳超聲軟指標(biāo)。胎兒頭臀長45 mm時(shí)，95%百分位數(shù)NT厚度為2.1 mm，胎兒頭臀長84 mm時(shí)，95%百分位數(shù)NT厚度為2.7 mm，99%百分位數(shù)NT厚度不隨頭臀長增加而改變[1-2]。2016年ACOG指南指出，孕11～14周NT＞3.0 mm或大于相應(yīng)胎兒頭臀長的99%百分位數(shù)視為NT增厚[3]，而國內(nèi)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)NT增厚的截?cái)嘀瞪形唇y(tǒng)一，其值從2.0～5.0 mm不等[4-5]， 將NT 2.5～3.0 mm視為臨界增厚，NT＞3.0 mm判斷為增厚最為常見。

1992年，NICOLAIDES等[6]首先發(fā)現(xiàn)孕早期胎兒NT的增厚與唐氏綜合征密切相關(guān)。NT除與染色體數(shù)目異常相關(guān)外還與致病性染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）存在相關(guān)性，檢出率為0～15%[7-11]。傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)只能檢測(cè)片段5～10 Mb的染色體畸變，而染色體芯片技術(shù)（chromosomal microarray，CMA）可將分辨率提高到100 kb，能在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色體CNVs[12]。單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技術(shù)是一種較新的CMA，可以檢出染色體微缺失、微重復(fù)和雜合性缺失，近年來已被廣泛運(yùn)用到先天性異常、認(rèn)知缺陷、發(fā)育遲緩或行為問題的診斷中[13]。本研究聯(lián)合應(yīng)用染色體核型分析技術(shù)與SNP array技術(shù)，對(duì)220例孕早期超聲NT增厚的胎兒進(jìn)行檢測(cè)，明確NT增厚胎兒的遺傳學(xué)病因，分析胎兒NT增厚與染色體異常及CNVs之間的相關(guān)性，探討SNP array在NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選擇2013年8月至2019年4月在溫州市產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷，妊娠11～13+6周超聲篩查提示胎兒NT＞2.5 mm的孕婦220例，孕婦年齡21～44歲，中位年齡31歲，NT厚度2.5～9.0 mm， 中位厚度3.4 mm。所有孕婦均簽署知情同意書，并進(jìn)行臨床資料登記，包括年齡、家族史、接觸史、產(chǎn)前診斷結(jié)果等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理：無菌條件下穿刺取材。孕11～13周的孕婦選擇超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹絨毛膜穿刺術(shù)，抽取少量絨毛組織；孕16～24周的孕婦選擇超聲定位下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，抽取30 mL羊水；孕25～38 周的孕婦選擇超聲定位下經(jīng)腹臍靜脈穿刺術(shù)，抽取臍靜脈血2～3 mL。

1.2.2 染色體核型分析：采用常規(guī)方法行絨毛、羊水和臍血細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、固定、核型制備和G顯帶。染色體異常的分析和描述標(biāo)準(zhǔn)依照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名標(biāo)準(zhǔn)2016版》。

1.2.3 DNA提取：采用博爾誠公司的基因組DNA提取試劑盒，提取總DNA，用Nano Drop 2000UV-vis測(cè)定DNA純度和OD值（λ260/λ280），OD值1.8～2.0為合格，并在管外壁上做好記錄。

1.2.4 SNP array技術(shù)檢測(cè)：采用Human Cyto SNP- 12 DNA Analysis Beadchip Kits（Illumina，USA）芯片，按照標(biāo)準(zhǔn)的操作手冊(cè)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增、DNA片段化、雜交、洗脫、單堿基延伸及染色、洗滌、包被及芯片掃描；或采用Affymetrix CytoScanTM750K Arrays（Affymetrix，USA）芯片，按照標(biāo)準(zhǔn)的操作手冊(cè)進(jìn)行全基因組DNA酶切、連接、PCR擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、芯片雜交、洗滌及掃描。

1.2.5 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及全基因組拷貝數(shù)分析：使用KaryoStudio軟件或ChAS 2.0軟件轉(zhuǎn)換原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)CNVs分析。首先將得到結(jié)果與已有的正常人群DGV數(shù)據(jù)庫（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）進(jìn)行比對(duì)分析，若發(fā)現(xiàn)CNVs在該數(shù)據(jù)庫中有報(bào)道，則將其視為多態(tài)性的CNVs或正常的CNVs；再與DECIPHER數(shù)據(jù)庫（http://decipher.sanger.ac.uk/）比對(duì)分析，是否為已報(bào)道明確癥狀的綜合征。對(duì)于仍然無法確定致病性的CNVs查詢PubMed數(shù)據(jù)庫，是否有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)于缺失或重復(fù)區(qū)域的基因功能查詢OMIM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）及GENE（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）等數(shù)據(jù)庫。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 220例產(chǎn)前標(biāo)本，包括絨毛16例，羊水189例，臍血15例，染色體核型分析檢出32例異常，異常率為14.5%。染色體數(shù)目異常占87.5%，結(jié)構(gòu)異常占12.5%。染色體數(shù)目異常中21 三體綜合征最常見（占43.8%），其次是18三體綜合征（占21.9%），還包括13三體綜合征2例（占6.2%），Turner綜合征4例（占12.5%），性別染色體嵌合1例（占3.1%）。同時(shí)檢出羅伯遜易位1例和染色體多態(tài)性8例。結(jié)果見表1。4例染色體結(jié)構(gòu)異常的核型圖見圖1。

表1 32例NT增厚胎兒異常核型及SNP芯片結(jié)果

圖1 4例染色體結(jié)構(gòu)異常的核型圖和芯片圖

2.2 SNP array分析結(jié)果 在染色體核型結(jié)果正常的NT增厚胎兒中，SNP array額外檢出致病性CNVs 5例，疑似致病性CNVs 4例。除1例大片段嵌合型重復(fù)，其余8例均為微缺失或微重復(fù)，大小0.54～10.10 Mb，包括1例DiGeorge綜合征和2例Williams-Beuren綜合征，結(jié)果見圖2。SNP array技術(shù)染色體異常檢出率為18.6%，與染色體核型分析（為14.5%）相比，提高了4.1%。另外，6.82%（15/220）的標(biāo)本攜帶意義未明CNVs。結(jié)果見表2。

2.3 NT厚度與胎兒染色體異常及CNVs的相關(guān)性分析 按NT厚度2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm及≥3.5 mm將病例分3組，當(dāng)NT≥3.5 mm時(shí)，SNP array技術(shù)在NT增厚胎兒中共檢出31例異常CNVs，與單純核型分析檢出24例相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NT厚度為3.0～3.4 mm時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見表3。

圖2 8例微缺失或微重復(fù)SNP array圖

3 討論

NT厚度被公認(rèn)為產(chǎn)前篩查染色體異常和多種胎兒畸形的有效超聲軟指標(biāo)。NT增厚胎兒中，大約20%存在染色體異常[14]。SNIJDERS等[1]調(diào)查了96 127例NT增厚胎兒，發(fā)現(xiàn)染色體異常中約50%為21三體綜合征，25%為18三體綜合征或13三體綜合征，10%為Turner綜合征，5%為三倍體，10%為其他染色體異常。本組220例NT增厚胎兒中，染色體核型分析檢出32例異常，異常率為14.5%，數(shù)目異常占87.5%，結(jié)構(gòu)異常占12.5%，其中21三體綜合征14例（占43.8%），其次是18三體綜合征7例（占21.9%），13三體綜合征2例（占6.2%），Turner綜合征4例（占12.5%），性別染色體嵌合1例（占3.1%）和染色體結(jié)構(gòu)異常4例（占12.5%），除未見三倍體外，其余與文獻(xiàn)相符。

NT增厚除與染色體數(shù)目異常密切相關(guān)外，還與致病性染色體CNVs存在相關(guān)性，異常率約0～15%[7-11]。 PAN等[15]對(duì)122例熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）檢測(cè)結(jié)果正常的NT＞3.5 mm病例行CMA檢測(cè)，可額外檢出致病性CNVs 7例（占5.7%），其中3例微缺失/微重復(fù)無法被傳統(tǒng)的核型分析識(shí)別。LEUNG等[16]發(fā)現(xiàn)，微缺失/微重復(fù)綜合征在染色體核型正常的NT增厚胎兒中發(fā)生率約10%，若中期合并其他超聲結(jié)構(gòu)異常，微缺失/微重復(fù)發(fā)生率則更高。本研究通過SNP array技術(shù)明確了4 例染色體核型結(jié)構(gòu)異常的片段性質(zhì)，同時(shí)在染色體正常胎兒中額外檢測(cè)出9例異常CNVs，5例致病性CNVs和4例疑似致病CNVs。因此，聯(lián)合應(yīng)用SNP array檢測(cè)可提高NT增厚胎兒染色體CNVs的檢出率，同時(shí)可明確染色體結(jié)構(gòu)異常的片段性質(zhì)，為臨床遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

本研究檢出的3例致病性CNVs為DiGeorge綜合征和Williams-Beuren綜合征。DiGeorge綜合征（22q11.2微缺失綜合征）由22q11.2上約3 Mb的片段缺失引起的，是最常見的染色體微缺失綜合征之一，新生兒發(fā)病率為1/4 000，主要臨床表型為心臟缺損、免疫缺陷、語言延遲，腭咽閉合不良、行為和精神異常、特殊而容和低鈣血癥等[17]。約94% DiGeorge綜合征病例的缺失是新生的，6%則遺傳自父母中的一方[18]。Williams-Beuren綜合征是指由7q11.23上約1.5 Mb的片段缺失引起的，新生兒發(fā)病率為1/25 000～1/7 500，主要臨床表型為心血管系統(tǒng)疾病、特殊面容、智力低下、神經(jīng)行為異常 等[19]。

表2 9例核型正常的SNP array檢測(cè)結(jié)果

表3 不同NT厚度組間異常檢出率的比較[例（%）]

近年研究發(fā)現(xiàn)，早孕期的NT增厚與染色體異常、主要先天畸形、圍產(chǎn)期胎兒損失以及不良結(jié)局相關(guān)，并隨著NT增厚的程度風(fēng)險(xiǎn)逐漸加大。NT厚度2.5～ 3.5 mm時(shí)，異常率為3.7%，NT厚度3.5～4.4 mm時(shí)為21.1%，NT厚度4.5～5.4 mm時(shí)為33.3%，NT厚度5.5～6.4 mm時(shí)為50.5%，NT厚度≥6.5 mm時(shí)為64.5%[20]。本研究按NT厚度2.5～2.9 mm、3.0～ 3.4 mm及≥3.5 mm將病例分3組，核型異常率分別為5.6%、7.9%和23.3%，SNP array異常率分別為5.6%、11.1%和30.1%，胎兒染色體異常率隨NT厚度增加顯著增加，與文獻(xiàn)相符。MAYA等[21]分析了1 588例NT增厚胎兒CMA結(jié)果，其中胎兒NT厚度≤2.9 mm、 3.0～3.4 mm和≥3.5 mm的致病性CNVs檢出率分別為1.7%、6.5%和13.8%，認(rèn)為NT增厚胎兒行CMA檢測(cè)的cut-off值可定在3.0～3.4 mm。本研究中當(dāng)NT≥3.5 mm時(shí)，應(yīng)用SNP array技術(shù)在NT增厚胎兒中共檢出31例異常CNVs，與單純核型分析檢出24例相比，可將遺傳學(xué)病因的檢出率提高6.8%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NT厚度為3.0～ 3.4 mm時(shí)，檢出率僅提高3.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此筆者認(rèn)為，SNP array技術(shù)對(duì)于NT≥3.5 mm胎兒有更高的檢測(cè)價(jià)值。

綜上所述，NT增厚與染色體異常相關(guān)，隨著NT厚度增加，胎兒染色體異常率顯著增加。當(dāng)NT≥ 3.5 mm時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用核型分析技術(shù)和SNP array技術(shù)對(duì)NT增厚的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷，可將遺傳學(xué)病因的檢出率提高6.8%。