史 悅，高 楓

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.延安市中醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 延安 716000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)為臨床一類(lèi)嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為脊髓受損后其主要功能包括感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、反射等功能出現(xiàn)障礙。急性脊髓損傷發(fā)病急、致殘率高，且治療難度大，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，因此通過(guò)研究該病發(fā)病機(jī)制以探究更有效的治療方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究指出[1]，脊髓損傷后引起的機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，及其造成的繼發(fā)性脊髓損傷是影響脊髓損傷患者預(yù)后的重要因素。因此減輕脊髓損傷早期炎性反應(yīng)是治療的關(guān)鍵之一。

黃芪成分眾多，主要包括黃芪多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)及多種微量元素，已被證實(shí)黃芪糖蛋白可有效降低自身免疫性脊髓炎小鼠脊髓組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，改善脫髓鞘[2]。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡與脊髓損傷發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)旨在探討黃芪糖蛋白通過(guò)Nrf2/NQO1信號(hào)通路對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能及炎癥因子的影響，為黃芪糖蛋白在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及觀察組，每組10只。鼠齡6～7周，體重220～250 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SYXK(京)2018-0 003，本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作均遵守動(dòng)物倫理保護(hù)法。

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計(jì)(752-P，上海佑科儀器儀表有限公司)；冷凍離心機(jī)(Microfuge20R，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；PCR儀(CFX96，山東科艾瑞生物科技有限公司)

1.1.3 主要試劑 黃芪糖蛋白(純度>98%，自制)。NaCl注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20153227；湖北科倫藥業(yè)有限公司)；RNAisoPlus試劑(寶生物工程大連有限公司)；FastQuant逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；TNF-α檢測(cè)試劑盒(上海天呈醫(yī)流科技有限公司)；MPO檢測(cè)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；IL-6檢測(cè)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；Nrf2多克隆抗體(艾柏森生物科技有限公司)；NQO1多克隆抗體(武漢愛(ài)博泰生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)；PMSF裂解液(上海聯(lián)邁生物工程)。

1.2 方法

1.2.1 黃芪糖蛋白制備 從黃芪水提取液中經(jīng)硫酸銨鹽析，通過(guò)Sevage法將游離蛋白質(zhì)去除，經(jīng)透析與DEAE-C32陰離子交換樹(shù)脂柱層析，分離純化，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析得到黃芪糖蛋白；采用高碘酸-Schiff試劑染色法鑒定)。

1.2.2 急性脊髓損傷大鼠模型建立[3]假手術(shù)組大鼠切除T9～T11椎板及棘突，模型組及觀察組大鼠切除T9～T11椎板及棘突后，采用改良Allen’s法擊打大鼠T10節(jié)段脊髓，損傷直徑2～3 cm。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為：擊打后大鼠全身抖動(dòng)，后肢均回縮撲動(dòng)且有搖尾反射，后肢均呈弛緩性癱瘓。術(shù)后立即給予大鼠腹腔注射9.0 mL/kg氯化鈉注射液，直至大鼠清醒后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。

1.2.3 給藥方法 假手術(shù)組及模型組大鼠分別腹腔注射1.0 mg/kg 0.9%NaCl注射液，觀察組大鼠給予腹腔注射1.0 mg/kg黃芪糖蛋白，1次/d，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.4 BBB評(píng)分 大鼠脊髓損傷模型造模成功及采用黃芪糖蛋白干預(yù)后采用BBB(basso,beattie & bresnahan locomotor raing scale,BBB scale)分級(jí)法對(duì)治療后大鼠脊髓損傷后后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)將試驗(yàn)SD大鼠放置于寬敞的開(kāi)口容器中，密切檢測(cè)并觀察大鼠爬行時(shí)其行走和驅(qū)干運(yùn)動(dòng)時(shí)膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)能力及協(xié)調(diào)情況，總分共計(jì)范圍為0～21分，于干預(yù)1周、2周、4周評(píng)估大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能，分值越高表明大鼠后肢功能恢復(fù)越好，每只大鼠重復(fù)測(cè)試3次，取其平均值，本試驗(yàn)采用雙盲、雙人獨(dú)立評(píng)分。

1.2.5 炎性及氧化應(yīng)激因子水平 大鼠末次肢體功能評(píng)定后，脊椎脫臼法處死大鼠，暴露脊髓組織，取3組脊髓組織，分別將1 g脊髓組織與生理鹽水按1∶9比例置于研缽內(nèi)研磨、勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 熒光定量PCR檢測(cè)大鼠脊髓組織核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf 2)和醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)基因表達(dá)取約1 g脊髓組織于液氮置于研缽內(nèi)研磨充分后，依照RNAiso Plus試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)純度。然后使用FastQuant逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板建立反應(yīng)體系。以β-actin為內(nèi)參，引物由TAKARA公司設(shè)計(jì)合成(引物序列見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組肢體運(yùn)動(dòng)功能比較

假手術(shù)組、觀察組、模型組大鼠術(shù)前運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)1周、2周、4周后，觀察組與模型組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分低于假手術(shù)組(P<0.05)，且觀察組評(píng)分高于模型組(P<0.05，表2)。

表2 大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能比較

2.2 各組炎性因子水平比較

觀察組、模型組大鼠TNF-α、MPO、IL-6水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，且觀察組因子水平低于模型組(P<0.05，表3)。

表3 大鼠炎性因子水平比較

2.3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、NQO1mRNA表達(dá)水平

觀察組、模型組大鼠脊髓組織Nrf2、NQO1mRNA表達(dá)水平低于假手術(shù)組(P<0.05)，且觀察組表達(dá)水平高于模型組(P<0.05，表4)。

表4 大鼠脊髓組織Nrf2、NQO1mRNA表達(dá)水平

2.4 各組大鼠脊髓組織Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)

假手術(shù)組、模型組、觀察組大鼠脊髓組織Nrf2蛋白表達(dá)量為1.24±0.33、0.54±0.15、1.17±0.26，NQO1蛋白表達(dá)量為1.78±0.24、1.15±0.32、1.51±0.32；模型組與觀察組Nrf2、NQO1蛋白量降低，且觀察組高于模型組(P<0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠脊髓組織Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)情況

3 討論

脊髓損傷發(fā)生后，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)組織缺血性水腫、神經(jīng)元壞死以及局部免疫炎性反應(yīng)等一系列病理生理過(guò)程[4]。相關(guān)研究指出[5]，脊髓繼發(fā)性損傷破壞血脊髓屏障，導(dǎo)致血管內(nèi)容物滲出以及大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致脊髓損傷患者殘疾甚至死亡的關(guān)鍵因素。而在脊髓繼發(fā)性損傷發(fā)生過(guò)程中，免疫炎性反應(yīng)占據(jù)重要地位。脊髓損傷后病變部位的微環(huán)境導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子升高，炎癥因子通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)和級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)破壞受損組織，加重病情。降低MPO、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，能有效降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)SCI恢復(fù)正常功能。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[6]，NF-κB在脊髓組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，脊髓損傷發(fā)生時(shí)可激活神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞上的NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，促使靶基因表達(dá)，釋放大量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6，形成炎性擴(kuò)增效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，加重繼發(fā)性脊髓損傷。因此如何有效地抑制脊髓損傷后機(jī)體炎性反應(yīng)是目前臨床研究的熱點(diǎn)。

黃芪糖蛋白提取自傳統(tǒng)中藥膜莢黃芪，已被證實(shí)具有顯著抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[7]。本研究中給予觀察組急性脊髓損傷大鼠黃芪糖蛋白腹腔注射治療，結(jié)果顯示干預(yù)1、2、4周，觀察組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能均優(yōu)于模型組，TNF-α、IL-6水平低于模型組，可見(jiàn)黃芪糖蛋白能有效抑制急性脊髓損傷大鼠炎性反應(yīng)，改善神經(jīng)功能，提高其運(yùn)動(dòng)能力。

文獻(xiàn)報(bào)道[8]，Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，激活該通路可顯著提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)感應(yīng)器，屬堿性亮氨酸拉鏈家族，NQO1為Nrf2/ARE信號(hào)通路的下游因子。張莉等[9]研究指出，誘導(dǎo)Nrf2/ARE信號(hào)通路活化，可增加其下游因子NQO1表達(dá)水平，在腦出血大鼠模型中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。MPO是一種過(guò)氧化物酶超家族亞鐵血紅素酶，廣泛存在于單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞中，具備溶酶體酶和過(guò)氧化物酶活性，能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝以及氧化損傷等過(guò)程，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。從本研究結(jié)果看，干預(yù)4周后假手術(shù)組、觀察組、模型組大鼠脊髓組織MPO水平依次升高，Nrf2、NQO1mRNA及蛋白表達(dá)水平依次降低，可知觀察組急性脊髓損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)較輕，提示黃芪糖蛋白可能通過(guò)激活急性脊髓損傷大鼠Nrf2/ARE通路，上調(diào)NQO1表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到降低繼發(fā)性脊髓損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，黃芪糖蛋白能有效改善大鼠SCI情況，經(jīng)黃芪糖蛋白治療后后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)更協(xié)調(diào)、運(yùn)動(dòng)幅度增大、腳趾抓取力、負(fù)重前行力更大等。黃芪糖蛋白治療SCI的作用機(jī)制可能通過(guò)Nrf2/ARE通路，上調(diào)NQO1表達(dá)降低IL-6、TNF-α、MPO含量，從而促進(jìn)SCI大鼠的恢復(fù)。這提示黃芪糖蛋白在治療SCI方面具有良好的臨床效果和潛在的應(yīng)用價(jià)值，為臨床靶向治療SCI并發(fā)癥提供一定的的理論基礎(chǔ)和可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。