潘顯茂 鄭英換 李蘭婷 孔海潔 吳佳穎

摘要?[目的]初步篩查海南狗牙花抗腫瘤活性部位。[方法]采用MTT比色法測定海南狗牙花4種提取物分別對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）和人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）體外生長抑制作用。[結(jié)果]海南狗牙花4種提取物對2種腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同的抑制活性，乙酸乙酯提取物的抗腫瘤活性最強，石油醚提取物次之，正丁醇萃取物較弱而萃取后的水層無抗腫瘤活性。[結(jié)論]該研究為深入研究海南狗牙花中具有抗腫瘤活性的單體化合物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞?海南狗牙花;提取物;抗腫瘤活性;MTT比色法

中圖分類號?R284;R285?文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0160-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.043

Abstract?[Objective]To initially screen the anti-tumor active parts of Ervatamia hainanensis.[Method]MTT colourometry was used to determine the inhibitory effect of four extracts of Ervatamia hainanensis on A549 and MCF-7 human tumor cells in vitro.[Result]The four extracts of Ervatamia hainanensis showed different inhibitory activities on two kinds of tumor cells， the anti-tumor activity of the ethyl acetate extract was the strongest， the petroleum ether was the second， the n-butanol extract was weak， and the aqueous layer after the extraction had no anti-tumor activity.[Conclusion]This research provides scientific basis for the in-depth study of the monomeric compounds with anti-tumor activity in Ervatamia hainanensis.

Key words?Ervatamia hainanensis;Extractive;Anti-tumor activity;MTT colourometry

海南狗牙花（Ervatamia hainanensis Tsiang），夾竹桃科狗牙花屬灌木，又名單根木，主要分布在我國云南、廣西、海南等地區(qū)，是一種民間中草藥。海南狗牙花，味苦、辛，性涼，主治清熱解毒、降血壓、降血脂、消腫止痛，治療腹痛和咽喉腫痛等[1]。現(xiàn)代研究表明，海南狗牙花中含有生物堿、三萜類、木質(zhì)素、甾醇等多種化學(xué)成分，有不少研究發(fā)現(xiàn)，狗牙花提取物中還含有抗腫瘤活性成分，顯示出對某些癌細(xì)胞具有抑制作用[2-9]。該研究將海南狗牙花根莖進行充分提取并分離出乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物和萃取后的水層4種組分，將這4種組分分別作為藥物給予，作用于人乳腺管癌細(xì)胞MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，采用MTT檢測法進行藥物毒性試驗，初步研究其抗腫瘤活性，為深入研究海南狗牙花中具有抗腫瘤活性的單體化合物提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?主要儀器。分析天平（BSA124S-CW，賽多利斯）;二氧化碳培養(yǎng)箱（BPN-170RWP，上海一恒）;臺式低速離心機（TD-5M，山東博科）;倒置相差顯微鏡（DM IL LED ，LEICA）;全自動細(xì)胞計數(shù)儀（Countess Ⅱ，Thermo Scientific）;酶標(biāo)儀（F-50，TECAN）;微孔板恒溫振蕩器（YMB100-4A，上海熙揚）;智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（YRE-2020A，杭州億捷科技）;減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Hei-VAP advantage，德國海道爾夫）。

1.1.2?試劑。高糖DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（1 000 IU/mL）、PBS、0.25% 胰酶消化液（含EDTA，酚紅），均購置于GBIGO公司;噻唑藍(lán)（MTT），購置于 SIGMA公司;二甲基亞砜（DMSO）、95% 乙醇、石油醚（I）、正丁醇、乙酸乙酯均為分析純，購置于廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.3?藥材。海南狗牙花采自海南省白沙黎族自治縣鸚哥嶺。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所鄭希龍博士鑒定。

1.1.4?細(xì)胞株。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）均為貼壁細(xì)胞，并購置于北納生物技術(shù)有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?海南狗牙花活性部位的提取。

取海南狗牙花干燥根莖1 kg，粉碎，95%乙醇靜置提取，過濾除去藥渣，濾液置減壓蒸餾裝置中，蒸餾得浸膏，浸膏使用蒸餾水分散后，用石油醚（Ⅰ）、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，得到海南狗牙花石油醚組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分和水層組分，均減壓蒸干溶劑，得4組提取物，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?體外抗腫瘤試驗方法。

1.2.2.1?試驗分組及劑量設(shè)計。分別稱取海南狗牙花石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后水層4種萃取物適量，加DMSO助溶使藥物充分溶解于純化水中，制成200 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前用含血清的細(xì)胞完全培養(yǎng)液梯度稀釋至4 000、2 000、1 000、500、250 μg/mL進行MTT試驗。此次MTT試驗狗牙花每種提取物均設(shè)5個劑量組，最終濃度分別為400、200、100、50、25 μg/mL，每個劑量組均為6個復(fù)孔，試驗同時設(shè)空白組（含細(xì)胞和等量完全培養(yǎng)液）和調(diào)零孔（不含細(xì)胞含等量完全培養(yǎng)液）。

1.2.2.2?A549細(xì)胞處理方法。

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計數(shù)，用含有10%小牛血清的高糖DMED細(xì)胞完全培養(yǎng)液制成5.5×104個/mL的細(xì)胞懸液，按180?μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后分別加入不同濃度的試驗樣品20?μL（空白組加20?μL完全培養(yǎng)液），置培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24和48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗板1次，再加入100?μL無血清培養(yǎng)基和20?μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄液，每孔加150?μL DMSO避光振蕩（37 ℃）混勻10?min，使結(jié)晶完全溶解。

1.2.2.3?MCF-7細(xì)胞處理方法。

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計數(shù)，用含有10%小牛血清的高糖DMED細(xì)胞完全培養(yǎng)液制成1.0×105個/mL的細(xì)胞懸液，按100?μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待96孔板中MCF-7細(xì)胞生長接近匯合后，棄去原培養(yǎng)液，每孔分別加入180?μL完全培養(yǎng)液和不同濃度的試驗樣品20?μL（空白組加200?μL完全培養(yǎng)液），置培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24和48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗板1次，每孔分別加入100?μL無血清培養(yǎng)基和20?μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄液，每孔加100?μL DMSO避光振蕩（37 ℃）混勻10 min，使結(jié)晶完全溶解。

1.2.2.4?MTT試驗結(jié)果檢測和數(shù)據(jù)處理方法。

取上述處理完成的96孔試驗板置酶標(biāo)儀于492 nm波長處測定每孔吸光度（OD），然后按照下式進行藥物對細(xì)胞生長抑制率的計算：細(xì)胞生長抑制率=[1-（樣品組OD值-調(diào)零組OD值）/（空白組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%[10]。試驗數(shù)據(jù)用±S表示，采用SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)合藥物濃度推算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2?結(jié)果與分析

2.1?海南狗牙花初步提取分離?取干燥海南狗牙花根莖1 kg，粉碎，用95%乙醇冷浸7 d，濾過，取濾液減壓回流濃縮至無醇味，得總浸膏148 g，總浸膏用適量水混懸，濾過，用石油醚（Ⅰ）、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取3次，收集萃取溶劑，分別減壓回流濃縮至干，得石油醚提取組分0.11 g、乙酸乙酯提取組分0.85 g、正丁醇提取組分1.74 g、水組分4.13 g。

2.2?海南狗牙花提取物對腫瘤細(xì)胞生長抑制的影響

從表1可以看出，海南狗牙花石油醚提取組分和乙酸乙酯提取組分對A549和MCF-7腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強。其中，海南狗牙花乙酸乙酯萃取物對MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制活性最強，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在該試驗研究條件下，當(dāng)藥物濃度達(dá)到400 μg/mL時，海南狗牙花正丁醇提取物和水提取物對A549和MCF-7腫瘤細(xì)胞無明顯的抑制活性。

2.3?海南狗牙花提取物對腫瘤細(xì)胞的IC50值?從表2可以看出，海南狗牙花乙酸乙酯提取物對A549和MCF-7腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值均低于石油醚提取物的IC50值，由此表明海南狗牙花乙酸乙酯部位的抗癌活性優(yōu)于石油醚部位。海南狗牙花藥物作用48 h時的 IC50值均低于24 h時的IC50值，說明隨著作用時間的延長，其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用越明顯。

3?結(jié)論與討論

海南狗牙花是我國南方特有的夾竹桃科狗牙花屬植物，查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)海南狗牙花植物中富含生物堿，具有防治精神依賴和抗腫瘤等作用[2]。此次體外抗腫瘤活性試驗結(jié)果表明，海南狗牙花4種提取組分中，石油醚提取組分和乙酸乙酯提取組分對癌細(xì)胞MCF-7和A549具有較強的抑制效果，其中乙酸乙酯提取組分抗癌活性優(yōu)于石油醚組分且對MCF-7細(xì)胞的抑制活性最強，而正丁醇組分和水組分則沒有抑制效果。海南狗牙花提取物對腫瘤細(xì)胞作用時間延長至48 h時，其石油醚組分和乙酸乙酯組分濃度在400 μg/mL時對抗癌細(xì)胞抑制效果明顯，抑制率均達(dá)到80%以上，而在低濃度時抗癌細(xì)胞抑制效果較弱，這可能是與高濃度藥物有利于通過被動轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞膜內(nèi)且對細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用有關(guān)。

后續(xù)將根據(jù)此次試驗研究結(jié)果，對海南狗牙花提取物的抗腫瘤活性成分進一步分離純化后，再進行更多瘤株的抑制活性篩選，為海南狗牙花抗腫瘤活性作用建立藥效學(xué)基礎(chǔ)，可用作為抗腫瘤藥物研發(fā)的科學(xué)依據(jù)。

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