楊棟林 方軼男 潘巍 侯叢林 吳荻 廖文雪

摘要?海菜花（Ottelia acuminata）作為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物，是一種既可觀賞又可食用的植物。就海菜花生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生物質(zhì)，以種植水的形式對(duì)2種沉水植物（菹草和密刺苦草）的生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，密刺苦草在不同濃度的海菜花種植水中過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯下降，丙二醛（MDA）含量下降，總?cè)~綠素濃度亦有明顯的下降，說(shuō)明密刺苦草對(duì)于海菜花種植水中的化感物質(zhì)表現(xiàn)出明顯抗性，海菜花對(duì)于密刺苦草的生長(zhǎng)起抑制作用。菹草SOD活性出現(xiàn)了明顯下降，MDA含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，葉綠素濃度亦是先下降后上升，但是最初呈現(xiàn)的下降趨勢(shì)均不明顯。說(shuō)明海菜花的化感作用對(duì)于密刺苦草比菹草的敏感，密刺苦草更容易受到海菜花化感物質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞?海菜花;種植水;沉水植物;抗逆性;影響

中圖分類號(hào)?Q945?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）01-0066-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.017

Abstract?As a secondary protected plant in China， Ottelia acuminata is an ornamental and edible plant. In this paper，the secondary substances produced during the growth of sea cauliflower were used to study the effects of planting water on the growth of two submerged plants （Vallisneria natans and Potamogeton crispus）. The results showed that the peroxidase （POD） activity， the superoxide dismutase （SOD） activity and the malondialdehyde （MDA） content in different concentrations of sea cauliflower planting water significantly decreased，the chlorophyll concentration also decreased significantly， which indicated that Vallisneria natans showed obvious resistance to allelochemicals in Ottelia acuminatea planting water， and Ottelia acuminata inhibited the growth of Vallisneria natans.The SOD activity of Potamogeton crispus showed a significant decline， the MDA content showed first decline and then upward trend， and the chlorophyll concentration also first declined and then increased， but the initial downward trend was not very obvious.It showed that the allelopathic effect of Ottelia acuminata was more sensitive to Vallisneria natans than Potamogeton crispus， which was more susceptible to the allelopathy of Ottelia acuminatea.

Key words?Ottelia acuminata;Planting water;Sediment plants;Resistance;Effect

海菜花（Ottelia acuminata），隸屬水鱉科（Hydrocharitaceae）水車前屬（Ottelia Pers.），一年生或多年生淡水湖泊特有的沉水植物[1]，既可作為觀賞景觀植物，又可作為人與一些水生動(dòng)物的食物[2]，對(duì)環(huán)境要求較高，尤其是對(duì)水體污染較為敏感[3-4]，可作為水體環(huán)境指標(biāo)性植物，是非常有研究?jī)r(jià)值的國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物[5]。

水生生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)于陸生生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，表現(xiàn)得更為復(fù)雜，沉水植物的化感作用實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證和研究均較難開展試驗(yàn)，所以一直沒(méi)有得到相應(yīng)的重視。而近2年來(lái)我國(guó)水體污染較為嚴(yán)重，沉水植物作為湖泊主要生產(chǎn)者，對(duì)于調(diào)節(jié)湖泊生態(tài)平衡有著重要影響[6-7]。但近年來(lái)人們大多傾向于沉水植物對(duì)藻類植物的影響進(jìn)行研究，而對(duì)沉水植物之間的相互關(guān)系相關(guān)的研究較少，筆者以2種沉水植物密刺苦草（Vallisneria natans）和菹草（Potamogeton crispus）為研究對(duì)象，對(duì)沉水植物之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)湖泊恢復(fù)建設(shè)中使用的復(fù)合恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)沉水植物間的搭配進(jìn)行探討。

1?材料與方法

1.1?材料

該研究所使用的海菜花（Ottelia acuminata）、密刺苦草（Vallisneria natans）和菹草（Potamogeton crispus）均采集于廣西桂林市永福縣百壽鎮(zhèn)。選取生長(zhǎng)健壯，根、莖、葉完好的植株用冰桶帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)自來(lái)水清洗干凈，用蒸餾水進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?種植水的制備。

將一定鮮重的海菜花茁壯植株種植于裝有5 L蒸餾水的大燒杯內(nèi)，在溫度為25 ℃、光暗時(shí)間比14 h∶10 h，光強(qiáng)4 000 lx的條件下培養(yǎng)7 d，取3 L種植水用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，并高溫滅菌處理，取得種植水的母液，設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.2.2?沉水植物的培養(yǎng)。

選取植株大小相似、株高10～15 cm的密刺苦草和菹草放入350 mL錐形瓶中，用陶瓷圈固定根部，每瓶1株，用蒸餾水（對(duì)照組）和海菜花種植水各300 mL進(jìn)行為期7 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃、光暗時(shí)間比14 h∶10 h、光強(qiáng)3 000 lx。為避免試驗(yàn)材料死亡影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)3個(gè)平行的對(duì)照組、6個(gè)平行的處理組。

1.2.3?過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定。

采用愈創(chuàng)木酚法[7]來(lái)測(cè)定2種沉水植物的POD活性，在POD的催化下，過(guò)氧化氫會(huì)與愈創(chuàng)木酚起氧化反應(yīng)，生成褐色產(chǎn)物。

式中，ΔA470指反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值;VT指提取酶液的體積;W指植物葉片凈鮮重;VS指試驗(yàn)所用酶液的體積;t為測(cè)量間隔時(shí)間（間隔1 min）。

1.2.4?超氧物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定。

采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法[8]測(cè)定SOD活性，SOD抑制氮藍(lán)四唑在光下的反應(yīng)。

在預(yù)冷的研缽中加入0.5 g植物葉片和1 mL磷酸緩沖液（pH=5.5），研磨成勻漿，用4 mL磷酸緩沖液分?jǐn)?shù)次沖洗并放入7 mL離心管中，離心（3 600 r/min，10 min，4 ℃），上清液即為SOD粗提液。取5支試管，2支為對(duì)照管、2支為測(cè)定管、1支為黑暗對(duì)照管。往試管中依次加入1 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH=5.5）、0.2 mL 130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液、0.2 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.2 mL 100 μmol/L EDTA-Na2溶液、0.2 mL核黃素溶液、0.05 mL酶液和1.15 mL蒸餾水。混勻后，除黑暗對(duì)照組被置于黑暗處外，其他的試管均放在4 000 lx日光下反應(yīng)20 min（要求各管受光程度一致）。 以不進(jìn)行黑暗處理得到對(duì)照管作為空白對(duì)照，在560 nm波長(zhǎng)下對(duì)其他試管進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.2.5?丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[9]測(cè)定2種沉水植物的MDA含量，MDA與TBA在高溫強(qiáng)酸條件下發(fā)生反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。

分別取2種供試的水生植物葉片0.5 g放入研缽中，加入5 mL 5% 三氯乙酸（TCA）溶液，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入7 mL離心管，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）。取2 mL離心后的上清液放入試管中，往試管中加入2 mL 0.67%TBA，混合均勻后置于100 ℃水浴鍋中煮沸30 min，取出試管靜置冷卻后再次離心。最后分別取適量的上清液置于450、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

式中，A532、A450、A600分別表示532、450、600 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.2.6?脯氨酸含量的測(cè)定。

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣本的提取、測(cè)定和計(jì)算方法參照李合生[10]的《植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)》。

1.2.7?葉綠素含量的測(cè)定。

取0.5 g洗凈的植物葉片，加入3 mL純丙酮、適量石英砂和碳酸鈣，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用80%丙酮沖洗研缽，并將沖洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中。以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液用80%丙酮定容至10 mL。取0.5 mL定容后的上清液，用4 mL 80%丙酮對(duì)上清液進(jìn)行稀釋，以80%丙酮作為對(duì)照，分別置于663、645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

式中，A663、A645分別表示663、645 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.3?數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?海菜花種植水對(duì)2種沉水植物POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高低與酚類物質(zhì)代謝息息相關(guān)。POD活性的高低反映植物內(nèi)在代謝的情況，并且能夠消除活性氧（ROS）和超氧陰離子自由基（O2·-）對(duì)細(xì)胞的傷害[11]。

由表1可知，相對(duì)于蒸餾水，密刺苦草在海菜花種植水中POD活性由196.357 7 U/（g·min）下降至56.432 7 U/（g·min），下降了72%，具有顯著性差異（P<0.05）。而菹草在海菜花種植水中，POD活性由169.537 1 U/（g·min）下降至86.875 4 U/（g·min），下降了49%，也具有顯著性差異（P<0.05），且密刺苦草POD活性較菹草而言下降較為顯著（P<0.05）。由此可知，海菜花種植水抑制了密刺苦草和菹草的POD活性，且密刺苦草受到的抑制作用更為嚴(yán)重。

2.2?海菜花種植水對(duì)2種沉水植物SOD活性的影響

SOD是能夠消除植物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的一種活性物質(zhì)，它幾乎存在于所有生命物體體內(nèi)，可以將有害的超氧陰離子自由基（O2·-）轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（H2O2），然后體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶（CAT）和POD可立即將轉(zhuǎn)化的H2O2分解，生成水和氧[12]，因此，SOD在生物體內(nèi)活性的高低水平是生物體的衰老和死亡的體現(xiàn)。

由表2可知，相對(duì)于蒸餾水的對(duì)照，在海菜花種植水中，密刺苦草的SOD活性均有所下降，且下降呈顯著差異（P<0.05），說(shuō)明海菜花化感作用對(duì)于密刺苦草的SOD活性有抑制作用;而在海菜花種植水中，菹草的SOD活性有輕微的下降，下降并不明顯（P>0.05），說(shuō)明海菜花種植水對(duì)菹草的SOD活性也有抑制作用，但是抑制作用表現(xiàn)得不明顯。由此可見，海菜花在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)供試的2種沉水植物的SOD活性都產(chǎn)生有害影響，不利于密刺苦草和菹草植物中O2·-的轉(zhuǎn)換，對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，但是密刺苦草所受的海菜花種植水脅迫作用更為顯著。

2.3?海菜花種植水對(duì)2種沉水植物MDA含量的影響

MDA是脂類過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，是較為常見的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫的條件下，可以與TBA反應(yīng)，生成粉紅色或者紅色的穩(wěn)定復(fù)合物，其吸收的最大波長(zhǎng)為532 nm[13]。植物衰老或環(huán)境改變受到脅迫時(shí)，自由基代謝失調(diào)，植物組織和器官的膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化還原反應(yīng)，從而生成MDA等物質(zhì)，導(dǎo)致其體內(nèi)MDA含量增加。

由表3可知，菹草在海菜花種植水中，MDA含量由0.915 μmol/L上升至0.981 μmol/L，上升了7.2%，表現(xiàn)不顯著（P>0.05），說(shuō)明菹草在海菜花種植水中脂類過(guò)氧化反應(yīng)增多，植物表現(xiàn)衰老狀態(tài)，即菹草對(duì)海菜花種植水中的化感物質(zhì)表現(xiàn)出了抗性。密刺苦草在不同的海菜花種植水中，MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由0.901 μmol/L降低至0.337 μmol/L，下降趨勢(shì)明顯（P<0.05），其可能原因有：①海菜花的化感作用對(duì)密刺苦草的MDA的產(chǎn)生起抑制作用，也就是海菜花化感作用抑制了密刺苦草的膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用;②密刺苦草對(duì)于海菜花的化感作用較為敏感，在海菜花種植水的影響下，膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)烈，MDA含量過(guò)高，膜脂質(zhì)和細(xì)胞受到的傷害在高濃度的海菜花次生物質(zhì)的影響中已近乎死亡。

2.4?海菜花種植水對(duì)2種沉水植物脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，研究表明，脯氨酸對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、成熟與變性蛋白的清除起重要作用[14]，在逆境環(huán)境中，脯氨酸含量高的植物抗逆性較強(qiáng)。

根據(jù)圖1的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出線性回歸方程y=0.038 5x+0.273 5，用此方程可以計(jì)算出用海菜花種植水培養(yǎng)后2種沉水植物的脯氨酸含量（表4）。

由表4可知，密刺苦草在海菜花種植水中比在蒸餾水對(duì)照中脯氨酸含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)（P<0.05），說(shuō)明密刺苦草對(duì)于海菜花化感物質(zhì)表現(xiàn)出了抗性，側(cè)面表明了密刺苦草受到海菜花脅迫作用越明顯。菹草在海菜花種植水中脯氨酸含量相對(duì)于蒸餾水（對(duì)照組），由9.950 6 μg/mL上升至10.015 6 μg/mL，且無(wú)明顯變化（P>0.05），其可能原因有：①菹草對(duì)于海菜花并沒(méi)有表現(xiàn)出相對(duì)的抗性，也就是說(shuō)菹草并沒(méi)有受到海菜花次生物質(zhì)的影響;②菹草對(duì)于海菜花種植水表現(xiàn)出了抗性，只是抗性并沒(méi)有密刺苦草表現(xiàn)的明顯。

2.5?海菜花種植水對(duì)2種沉水植物葉綠素含量的影響

葉綠素（chlorophyll）是一類與光合作用（photosynthesis）有關(guān)的重要色素，葉綠素的含量是反映植物健康狀態(tài)最常用的生態(tài)指標(biāo)之一[15]。

由表5可知，在一定濃度的海菜花種植水脅迫下，密刺苦草的葉綠素a與葉綠素b的濃度均表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)（P<0.05），海菜花種植水試驗(yàn)組密刺苦草的葉綠素a含量比對(duì)照組（蒸餾水組）下降57.9%，葉綠素b含量比對(duì)照組下降79.2%;海菜花種植水試驗(yàn)組菹草的葉綠素a含量比對(duì)照組下降7.6%，葉綠素b含量比對(duì)照組下降0.8%，下降趨勢(shì)不顯著（P>0.05）。由公式（5）得知，總?cè)~綠素含量受葉綠素a和葉綠素b的共同影響，由于密刺苦草的葉綠素a和葉綠素b含量都有所下降，所以其總?cè)~綠素含量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，且呈顯著差異（P<0.05）。植物體內(nèi)總?cè)~綠素含量下降表明該植物的健康狀況出現(xiàn)了問(wèn)題或者植物正在衰老甚至是死亡。從這一試驗(yàn)結(jié)果可知，海菜花化感物質(zhì)對(duì)密刺苦草的生長(zhǎng)產(chǎn)生了負(fù)面的影響。菹草在海菜花種植水中葉綠素a和葉綠素b的含量亦出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但下降的趨勢(shì)并不明顯（P>0.05），說(shuō)明在同等情況下菹草的生長(zhǎng)過(guò)程受到海菜花化感物質(zhì)的抑制影響比同一生境的密刺苦草輕。

3?結(jié)論

通過(guò)對(duì)經(jīng)海菜花種植水培養(yǎng)的2種水生植物（密刺苦草和菹草）葉片中POD活性、SOD活性、MDA含量、脯氨酸含量和葉綠素含量等指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)密刺苦草在海菜花種植水中POD和SOD活性有明顯的下降，MDA含量明顯下降，總?cè)~綠素含量亦有明顯的下降。綜上所述，海菜花生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)密刺苦草的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，并且密刺苦草對(duì)于海菜花化感作用反應(yīng)較為敏感。而菹草在上述的所有試驗(yàn)中，POD活性在海菜花種植水中變化并不明顯，SOD活性有輕微下降，MDA含量呈增高，葉綠素含量表現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此可見，密刺苦草和菹草在海菜花種植水的培養(yǎng)過(guò)程中，也就是在正常的水域環(huán)境中，均受到海菜花分泌的化感物質(zhì)的抑制作用，表現(xiàn)出了對(duì)海菜花化感物質(zhì)的抗性，但這2種沉水植物中，密刺苦草所受的化感作用表現(xiàn)較為敏感，表現(xiàn)的抗逆性較差。

在利用水生植物進(jìn)行水體污染治理中，應(yīng)當(dāng)選擇合適且合理的沉水植物搭配，從該試驗(yàn)得出的結(jié)果可以看出，海菜花與密刺苦草、菹草間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，密刺苦草與菹草對(duì)于海菜花化感物質(zhì)表現(xiàn)出抗性，且密刺苦草抗性表現(xiàn)十分明顯。所以在水體修復(fù)工程中對(duì)于沉水植物的選擇，海菜花與密刺苦草不應(yīng)一起使用，否則密刺苦草有可能在修復(fù)過(guò)程中被海菜花所抑制，達(dá)不到修復(fù)預(yù)期試驗(yàn)效果。

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