胡亞婕，劉 洋，姚睿智，史宏昭，劉 鵬，徐 彬，呂紅明，李士澤

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，動物醫(yī)學基礎國家級實驗教學示范中心；黑龍江省牛病防治重點實驗室，大慶 163319)

寒冷是北方畜牧業(yè)常見應激源之一，常誘導禽畜產生冷應激反應。在寒冷條件下，動物機體主要通過增強自身代謝活動和骨骼肌收縮來增加產熱從而維持體溫恒定。因此，冷暴露中骨骼肌的功能及能量水平對維持機體運動能力起著十分重要的作用。此外，骨骼肌除了作為運動器官，還可以作為分泌器官分泌細胞因子，即肌細胞因子(myokines)[1]。其中，IL-6作為骨骼肌分泌的重要肌細胞因子之一，通過骨骼肌收縮產生、表達和釋放，參與機體能量代謝[2-3]。而蛋白質O-GlcNAc糖基化修飾是細胞內一種蛋白翻譯后修飾方式，O-GlcNAc糖基化修飾可以在機體應激中充當一種“應激感受器”，參與細胞信號轉導，蛋白質-蛋白質相互作用或基因表達[4-5]。因此，本試驗使用小鼠成肌細胞系C2C12，檢測不同時長冷暴露下O-GlcNAc糖基化修飾及相關蛋白O-GlcNAc催化轉移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)、O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA)和IL-6表達變化。初步探討冷暴露下O-GlcNAc糖基化與IL-6表達之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成肌細胞系C2C12為黑龍江八一農墾大學應激實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Clark Bioscience公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF(100 mmol·L-1)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、10×TBST購自中國碧云天生物技術有限公司；ECL顯色液、PVDF膜(0.22 /0.45 μm)購自美國默克密理博公司。

抗體：Anti-O-linked-N-Acetylglucosamine(RL2，Abcam)，Anti-OGT/O-linked-N-Acetylglucosamine transferase(Abcam)，Anti-MGEA5/OGA antibody(Abcam)，Anti-IL-6 antibody(Abcam)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP，Abcam)，Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP，Abcam)，用于Western blot檢測。

1.2.2 主要儀器 SHP-250恒溫培養(yǎng)箱購自上海森信實驗儀器有限公司；TDL-5-A離心機購自上海安亭科學儀器廠；電泳槽、濕轉轉膜儀、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國伯樂有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及冷暴露處理

復蘇C2C12細胞，細胞瓶中加入5 mL培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、1%雙抗)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞增長到匯合率為80%～90%，傳代，擴增細胞。將C2C12細胞分為不做冷暴露處理的對照組(control組，37 ℃ ±0.5 ℃)、冷暴露(32 ℃±0.5 ℃，醫(yī)學臨床亞低溫溫度，已證實可引起體外培養(yǎng)細胞冷應激反應)組，其中，冷暴露組又分為冷暴露3、6、9、12 h組。待細胞增長至80%匯合率時進行試驗處理，具體試驗方案如圖1所示。

圖1 試驗方案Fig.1 Experiment scheme

1.4 總蛋白提取及Western blot分析

C2C12細胞經過不同時長冷暴露處理后，每瓶細胞加入PMSF終濃度為0.1 mmol·L-1的RIPA裂解液100 μL，然后使用細胞刮收集細胞至1.5 mL離心管，并于冰上裂解30 min。13 000 r·min-1離心10 min， 取上清。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒按照說明書測定所提取細胞總蛋白濃度，并用RIPA裂解液進行調整，使每組樣品蛋白濃度相同。將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按照4∶1的比例混合并煮沸，使蛋白變性。

按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制分離膠和濃縮膠。加入樣品，50 V恒壓電泳，待樣品進入分離膠時改為120 V恒壓電泳。電泳結束后，使用濕轉轉膜儀250 mA將凝膠上的蛋白條帶轉移至PVDF膜上，根據目的蛋白大小調整轉膜時間為1.0～2.5 h。轉膜結束后，PVDF膜用1×TBST溶液配制5%脫脂乳室溫封閉1 h，用1×TBST溶液脫洗PVDF膜3次，每次10 min。按照抗體說明書用TBST稀釋抗體，孵育過夜。次日洗膜3次，每次10 min。二抗室溫下孵育1 h，然后洗膜3次，每次10 min。將ECL顯色液按照1∶1配制，使用ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光觀察。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 不同時長冷暴露下OGT和OGA表達變化

O-GlcNAc糖基化修飾受兩種拮抗酶即OGT和OGA調節(jié)從而維持動態(tài)平衡。不同時長冷暴露下C2C12 中OGT及OGA表達變化水平如圖2所示，不同時長冷暴露處理C2C12細胞后，OGT、OGA表達增加。與對照組比較，冷暴露3 h處理組OGT表達水平顯著升高(P<0.05)，冷暴露12 h組OGT表達水平極顯著升高(P<0.01)(圖2B)，而OGA表達水平在冷暴露處理6 h時顯著升高(P<0.05)(圖2C)。

A. Western blot結果；B. OGT表達變化；C. OGA表達變化。數(shù)據用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. OGT expression changes; C. OGA expression changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖2 不同時長冷暴露下C2C12細胞OGT及OGA蛋白表達水平Fig.2 Expression of OGT and OGA protein in C2C12 cells to different durations of cold exposure

2.2 不同時長冷暴露下O-GlcNAc糖基化修飾變化

不同時長冷暴露處理后，C2C12細胞O-GlcNAc糖基化修飾水平見圖3，與對照組比較，不同時長冷暴露處理后，O-GlcNAc糖基化修飾水平升高，冷暴露3 h，O-GlcNAc糖基化修飾水平極顯著升高(P<0.01)。

A. Western blot結果；B. 糖基化修飾水平。數(shù)據用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. Glycosylation changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖3 不同時長冷暴露下C2C12細胞O-GlcNAc糖基化修飾水平Fig.3 Expression of O-GlcNAc glycosylation in C2C12 cells to different durations of cold exposure

2.3 不同時長冷暴露下IL-6表達變化

C2C12細胞經過不同時長冷暴露后，IL-6表達變化如圖4所示，與對照組相比，冷暴露處理3 h時，IL-6的表達水平極顯著升高(P<0.01)，冷暴露6 h，IL-6的表達水平較對照組顯著升高(P<0.05)，表達水平略低于冷暴露3 h，并且冷暴露9、12 h IL-6的表達水平持續(xù)升高。

A. Western blot結果；B. IL-6表達水平。數(shù)據用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. IL-6 expression changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖4 不同時長冷暴露下C2C12細胞IL-6蛋白表達水平Fig.4 Expression of IL-6 protein in C2C12 cells to different durations cold exposure

3 討 論

O-GlcNAc糖基化修飾是一種高度動態(tài)且可逆的過程。OGT和OGA兩種酶催化細胞內蛋白翻譯后的O-GlcNAc糖基化，對細胞內、核和線粒體信號蛋白的數(shù)千個絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)殘基進行修飾。OGT催化GlcNAc單糖從UDP-GlcNAc轉移至底物Ser/Thr殘基上，而OGA作用正好與OGT作用相反[6-7]。在冷暴露處理3 h時，OGT表達水平顯著增加(P<0.05)，冷暴露處理6 h時，OGA表達水平顯著增加(P<0.05)。OGT和OGA兩種調節(jié)酶共同調節(jié)O-GlcNAc糖基化修飾水平，并保持冷暴露3 h時O-GlcNAc糖基化高水平動態(tài)平衡。O-GlcNAc糖基化修飾作為“應激感受器”，當細胞感受到應激時，整體的O-GlcNAc修飾水平會增加[8]。O-GlcNAc糖基修飾動態(tài)可逆地調節(jié)細胞內代謝和信號通路，從而對各種應激作出迅速的反應[9]。Zachara等[10]用過氧化氫或亞砷酸鹽處理COS7細胞或小鼠胚胎成纖維細胞，構建細胞氧化應激模型，發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化水平升高。此外，在內質網應激和熱應激下O-GlcNAc糖基化水平升高[10-11]。而本試驗發(fā)現(xiàn)冷暴露處理使C2C12細胞中蛋白O-GlcNAc修飾水平升高，在冷暴露處理3 h時，表達極顯著升高(P<0.01)。O-GlcNAc 修飾水平在3 h時達到高峰，冷暴露6 h時O-GlcNAc糖基化修飾水平較3 h有所下降。但冷暴露6、9、12 h呈持續(xù)升高狀態(tài)。此外，Yao等[12]發(fā)現(xiàn)急性冷應激下小鼠整體O-GlcNAc糖基化水平升高，筆者的結果與之相符。

IL-6是一種典型的細胞因子，是具有多種生物學活性的一種糖基化蛋白。有研究表明，暴露于急性應激的人和嚙齒動物的外周IL-6水平升高[13-16]。并且Yildirim等[17]發(fā)現(xiàn)，冷應激可以誘導大鼠肝、肺、腦和心組織中IL-6表達增加。慢性間歇性冷應激也會改變大鼠腦內IL-6的表達[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)冷暴露處理C2C12細胞，與對照組相比，IL-6表達水平升高，在冷暴露處理3 h時，表達極顯著升高(P<0.01)。 因此，與其他研究結果相同，筆者發(fā)現(xiàn)冷應激引起C2C12細胞IL-6表達水平升高。Zhou等[14]研究發(fā)現(xiàn)束縛應激未造成大鼠組織損傷及炎癥，因此,IL-6在急性應激條件下發(fā)揮非免疫學功能。此外，Wernsted等[19]發(fā)現(xiàn)在4 ℃時，與野生型小鼠相比，IL-6-/-的耗氧量和核心溫度都較低，冷誘導產熱較低。這表明內源性IL-6對于小鼠在應激和冷誘導的能量消耗中起重要作用。并且Febbraio等[20]研究結果顯示，骨骼肌在收縮時分泌的IL-6引起的內源性葡萄糖產生增加，維持骨骼肌內糖原穩(wěn)定。Knudsen等[21]發(fā)現(xiàn)骨骼肌分泌IL-6可以調節(jié)葡萄糖攝取能力以及脂肪生成和脂肪分解，影響小鼠腹股溝白色脂肪組織質量。這些研究都表明IL-6的表達影響機體能量代謝。

此外，不同時長冷暴露處理下O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達趨勢高度一致，均在冷暴露3 h時顯著升高，冷暴露6、9、12 h持續(xù)升高。有研究表明，T、B淋巴細胞中OGT介導的活化T細胞1(activated T cells 1，NFATc 1)和NF-κB的O-GlcNAc糖基化修飾是淋巴細胞激活所必需的關鍵轉錄因子[22]。NFATc 1和NF-κB的O-GlcNAc糖基化修飾可以促進IL-6的轉錄。同時，NF-κB的RelA亞基的O-GlcNAc糖基化修飾后可以降低其與NF-κB抑制劑α(NF-κB inhibitor alpha，IκBα)的結合并增加其核轉位和轉錄活性[22-24]，進而激活下游信號。因此，筆者推測冷暴露導致C2C12細胞中O-GlcNAc糖基化修飾增加，激活NFATc 1以及NF-κB信號途徑，調控IL-6表達，進而調節(jié)骨骼肌中葡萄糖、脂質代謝，實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)調節(jié)，最終保護機體免受冷暴露的損傷。

4 結 論

不同時長冷暴露下，C2C12細胞中O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達水平顯著升高，冷暴露3 h下達到高峰。并且O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達趨勢高度相似，因此提示冷暴露下O-GlcNAc 糖基化修飾可能參與IL-6表達的調控，但O-GlcNAc糖基化修飾水平與IL-6表達之間的具體聯(lián)系還需進一步研究。