李永明 郭紹方 曲玉鳳 汪正威

（1 普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，普洱 665000；2 中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園森林生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223）

1 引言

蜜蜂是世界上最重要的傳粉昆蟲之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，蜜蜂作為社會(huì)性昆蟲，其復(fù)雜的社會(huì)性及其智能行為，是研究巢口行為計(jì)數(shù)的模式生物，蜜蜂巢門口行為很常見，卻很少受到關(guān)注。蜜蜂巢門口行為按照數(shù)量的多少，可分為兩大類：一類是發(fā)生時(shí)動(dòng)態(tài)數(shù)量少的，例如采集、守衛(wèi)、防御、盜蜂、理毛、移走、學(xué)習(xí)、認(rèn)知等行為[1]；另一類是發(fā)生時(shí)動(dòng)態(tài)數(shù)量較多的，有飛逃、婚飛、爽飛（幼蜂試飛）、分蜂等行為[2]。

對(duì)于蜜蜂的采集行為和婚飛行為[3]，目前，采用較多的門控技術(shù)，如無(wú)線射頻識(shí)別技術(shù)多用于巢口對(duì)進(jìn)出蜜蜂個(gè)體進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)推算其外出采集的時(shí)長(zhǎng)、頻次來(lái)分析蜂群行為[4]，或者通過(guò)不同感應(yīng)器設(shè)置，來(lái)記錄標(biāo)記和未標(biāo)記蜜蜂進(jìn)出巢口的頻次等行為[4]。對(duì)于巢口外一定空間距離的行為，則多通過(guò)單個(gè)攝像頭進(jìn)行視頻和圖像采集，來(lái)記錄和分析巢門口的進(jìn)出頻次。視角往往局限于巢口較小的范圍（REF）[5]，對(duì)于巢門口的動(dòng)態(tài)行為則相對(duì)關(guān)注較少。

蜜蜂待天氣晴朗時(shí)，將大量飛出蜂巢[6]。在巢口進(jìn)行初次出巢飛行，飛行時(shí)頭朝向蜂箱巢門口懸空飛翔，時(shí)高時(shí)低，主要完成自身排泄和認(rèn)巢，整個(gè)初次出巢飛行過(guò)程的持續(xù)時(shí)間與蜂群的強(qiáng)弱呈正相關(guān)，一般將持續(xù)數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)，此過(guò)程稱為蜜蜂的“爽飛”。此時(shí)由于數(shù)量眾多且飛行軌跡相對(duì)雜亂，形成一團(tuán)動(dòng)態(tài)蜜蜂“爽飛云團(tuán)”。若采用無(wú)線射頻識(shí)別技術(shù)對(duì)爽飛精準(zhǔn)計(jì)數(shù)難度系數(shù)很大，通道太少堵塞蜜蜂巢口，影響蜜蜂正常爽飛行為，同時(shí)個(gè)體間疊加、串聯(lián)等導(dǎo)致的計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。目前尚未有精準(zhǔn)、快速對(duì)爽飛行為等蜜蜂巢門行為計(jì)數(shù)的方法。

本文受啟發(fā)于photoshop 平面像素計(jì)數(shù)法介紹一種利用立體像素測(cè)量出蜜蜂巢門口爽飛數(shù)量的高效、精準(zhǔn)的方法[7]，同時(shí)，提出以ImageJ（https://imagej.net）記錄蜜蜂巢門口爽飛的計(jì)數(shù)方法及該方法的使用條件和標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)流程。本研究擬為后續(xù)智能蜂箱開發(fā)、蜜蜂巢門口行為研究以及胡蜂-蜜蜂攻防關(guān)系研究提供一定參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的東方蜜蜂和西方蜜蜂均為帶蜂王的健康蜂群，位于中國(guó)科學(xué)院西雙版納植物園西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。通過(guò)兩臺(tái)Gopro 8 高速運(yùn)動(dòng)相機(jī)于2020年7月至2020年9月對(duì)蜜蜂巢口行為進(jìn)行拍攝記錄。

2.2 研究方法

2.2.1 拍攝場(chǎng)景設(shè)置

將蜂群與三維系統(tǒng)觀測(cè)組合在一起，使蜂群適應(yīng)一周。待蜂群采集蜂正常出入采集后，在蜜蜂巢口布置好巢門口飛行記錄設(shè)備[8]，待蜂群出現(xiàn)爽飛時(shí)進(jìn)行拍攝。

2.2.2 高速運(yùn)動(dòng)相機(jī)拍攝

使用高速運(yùn)動(dòng)相機(jī)進(jìn)行側(cè)面和頂部拍攝（圖1）。通過(guò)俯視拍攝圖片和側(cè)面拍攝圖片從不同角度觀測(cè)爽飛行為，達(dá)到還原3D 場(chǎng)景的目的，從而更準(zhǔn)確的挖掘出爽飛數(shù)量變化曲線、時(shí)間。在進(jìn)行拍攝時(shí)，先架設(shè)好運(yùn)動(dòng)相機(jī)，調(diào)整到合適位置及拍攝角度并設(shè)定好程序后，待東方蜜蜂爽飛時(shí)兩臺(tái)相機(jī)同時(shí)開機(jī)，確保兩臺(tái)相機(jī)的同步性，對(duì)爽飛拍攝直至結(jié)束；拍攝時(shí)實(shí)驗(yàn)員記錄當(dāng)天環(huán)境變化、行為發(fā)生起始時(shí)間，胡蜂的分布、出現(xiàn)頻率以及捕食蜜蜂情況。對(duì)于西方蜜蜂爽飛拍攝方法與東方蜜蜂相同，最終得到有效數(shù)據(jù)180 組。

圖1 東、西方蜜蜂蜂巢門口“爽飛云團(tuán)”側(cè)面（A、C）和頂部（B、D）拍攝圖

2.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

對(duì)于180 組圖片數(shù)據(jù)，進(jìn)行記錄篩選分類整理，刪除部分損壞與角度錯(cuò)誤圖片，必要時(shí)有針對(duì)性的進(jìn)行補(bǔ)拍。分別對(duì)東方蜜蜂和西方蜜蜂以及俯視和側(cè)面數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，通過(guò)ImageJ 進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，最終得出此方法在不同環(huán)境下對(duì)東、西方蜜蜂爽飛計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率的差異。數(shù)據(jù)通過(guò)excel 進(jìn)行整理，通過(guò)卡方分析比較計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率。

3 結(jié)果與分析

分別整理出東方蜜蜂、西方蜜蜂爽飛時(shí)圖片，每種蜂分別選擇高清俯視圖和側(cè)視圖各90 張進(jìn)行分析。結(jié)果顯示東方蜜蜂與西方蜜蜂側(cè)視圖平均準(zhǔn)確率分別為95.89%、93.14%，俯視圖分別為96.62%、91.34%。30 只以下技術(shù)均可達(dá)到100%準(zhǔn)確率；隨著只數(shù)增加至60～90 只，準(zhǔn)確率仍達(dá)到95.47%（東方蜜蜂）、89.17%（西方蜜蜂）。西方蜜蜂達(dá)到100 只以上，準(zhǔn)確率仍在90%左右（圖2）。

東方蜜蜂拍攝場(chǎng)景搭建于較空曠、無(wú)建筑陰影地，而西方蜜蜂拍攝場(chǎng)景搭建于近樹木和建筑物的地段上，比較東方蜜蜂和西方蜜蜂各區(qū)間圖片數(shù)據(jù)，對(duì)于蜜蜂數(shù)量在30 只以下圖片，無(wú)論是東方蜜蜂還是西方蜜蜂、俯視（圖）還是側(cè)視（圖），計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率均達(dá)100%。側(cè)視圖分析結(jié)果表明：對(duì)于圖片蜜蜂數(shù)量在30～60 只的計(jì)數(shù)西方蜜蜂準(zhǔn)確率比東方蜜蜂高3.07%，對(duì)于圖片蜜蜂數(shù)量在60～90 只的計(jì)數(shù)東方蜜蜂比西方蜜蜂準(zhǔn)確率高5.82%，總體側(cè)視圖片東方蜜蜂準(zhǔn)確率比西方蜜蜂高2.75%。俯視圖分析結(jié)果表明：計(jì)數(shù)東方蜜蜂準(zhǔn)確率比西方蜜蜂高5.19%，但兩者準(zhǔn)確率均為90.00%以上，從變量數(shù)據(jù)比較結(jié)果可清晰看出該計(jì)數(shù)方法對(duì)爽飛行為計(jì)數(shù)同樣有效。而從整體數(shù)據(jù)中可看出在計(jì)數(shù)蜜蜂數(shù)量少時(shí)，計(jì)數(shù)西方蜜蜂較東方蜜蜂準(zhǔn)確，在記錄30～60 只時(shí)，計(jì)數(shù)東方蜜蜂準(zhǔn)確率較西方蜜蜂高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確率與蜂群拍攝場(chǎng)景的陰影投射面積呈負(fù)相關(guān)，東方蜜蜂巢門口陰影較少，對(duì)自動(dòng)計(jì)數(shù)干擾較小，而西方蜜蜂蜂群周圍有樹木建筑等陰影，對(duì)自動(dòng)計(jì)數(shù)干擾相對(duì)較大，數(shù)量眾多時(shí)，干擾更為明顯（圖2）。

圖2 東、西方蜜蜂ImageJ自動(dòng)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率比較

4 討論

ImageJ 自動(dòng)計(jì)數(shù)法適用于蜜蜂爽飛行為的計(jì)數(shù)，無(wú)論是蜜蜂數(shù)目較低的爽飛圖片（0～30 只），還是蜜蜂數(shù)目較高的爽飛圖片（90～180 只），此方法均表現(xiàn)出較高的可信度，與人工計(jì)數(shù)法計(jì)算的爽飛蜜蜂數(shù)差異較小。

蜜蜂在畫面中所占面積大小與相機(jī)鏡頭距離呈負(fù)相關(guān)，本次計(jì)數(shù)方法利用圖像處理，通過(guò)確定蜜蜂面積的范圍從而進(jìn)行精準(zhǔn)自動(dòng)計(jì)數(shù)，且計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。此外，Motic 面積計(jì)數(shù)法、PS 像素計(jì)數(shù)法[7]、Bayes 摳圖算法同為圖像處理利用面積計(jì)數(shù)，但計(jì)數(shù)原理是用計(jì)數(shù)總數(shù)=總區(qū)域面積（像素）/計(jì)數(shù)對(duì)象面積（像素）平均值進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)。此類計(jì)數(shù)方法在記錄立體空間中個(gè)體數(shù)量時(shí)受限較大，因?yàn)槊鄯湓诔查T口飛行，離鏡頭遠(yuǎn)近相差70cm，二者像素大小差異可達(dá)到7 倍；流式直接體積法也是利用計(jì)數(shù)總數(shù)=總區(qū)域體積/計(jì)數(shù)對(duì)象體積平均值進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，此方法更適用于活細(xì)胞類計(jì)數(shù)。此外，MATLAB 計(jì)數(shù)法是利用bwlabel函數(shù)對(duì)二值圖像進(jìn)行連通域自動(dòng)計(jì)數(shù)。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)ImageJ 自動(dòng)計(jì)數(shù)法與其他圖像面積處理法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：可針對(duì)因距相機(jī)距離不同導(dǎo)致面積不同的蜜蜂進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，提高可信度；可對(duì)拍攝飛行重疊而出現(xiàn)黏連的“蜜蜂片”分割，提高計(jì)數(shù)精度。缺點(diǎn)：需架設(shè)背景板以減少相應(yīng)的噪音信號(hào)，提高準(zhǔn)確率；需盡量避免強(qiáng)光及弱光拍攝，造成陰影導(dǎo)致圖像中對(duì)比度不一致甚至模糊記錄。

計(jì)數(shù)精準(zhǔn)度的提高是研究實(shí)驗(yàn)的重要前提，本研究結(jié)果表明，降低周圍干擾是提高計(jì)數(shù)精準(zhǔn)度的有效方法，降低干擾可從外界拍攝環(huán)境控制和軟件處理兩方面改進(jìn)。拍攝環(huán)境控制方面：拍攝爽飛行為時(shí)，最大限度降低干擾，可將拍照背景單一化處理，如可用白色擋板材料作為拍攝背景；天陰時(shí)或無(wú)強(qiáng)光造成陰影時(shí)，拍攝條件最佳；根據(jù)拍攝環(huán)境調(diào)整拍攝方位，避免陰影落入到拍攝空間。本實(shí)驗(yàn)得出從頂部拍攝和側(cè)面拍攝效果均比較理想。軟件處理方面：在對(duì)圖片計(jì)數(shù)時(shí)，軟件降噪是一種高效便捷的方法，對(duì)于原始圖片可進(jìn)行模糊處理，降低背景干擾，增加蜜蜂識(shí)別，計(jì)數(shù)參數(shù)設(shè)置尤為重要，需根據(jù)不同的圖片選擇面積范圍和圓度等。

蜜蜂巢門口除了能觀察到數(shù)量較多的爽飛行為，同時(shí)還能觀察到采集行為、防御行為等[9,10]。有經(jīng)驗(yàn)的蜂農(nóng)甚至可以在不開箱的情況下，通過(guò)在蜜蜂巢門口觀察采集行為以及爽飛行為來(lái)判斷蜂群的健康程度[11]。高效便捷的蜜蜂爽飛計(jì)數(shù)方法，不僅可以幫助我們實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)爽飛的發(fā)生時(shí)間、數(shù)量多少、蜂群強(qiáng)弱，更有助于我們快速對(duì)其繁殖期幼蜂數(shù)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控。本研究通過(guò)ImageJ 計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)用此方法能觀察較多蜜蜂數(shù)量巢口行為的爽飛行為，同時(shí)對(duì)較少蜜蜂數(shù)量的其他采集行為的準(zhǔn)確率會(huì)更高。此方法能為區(qū)分爽飛行為、飛逃行為等提供一定參考，可為后期智能蜂箱開發(fā)對(duì)巢口行為監(jiān)測(cè)提供一定理論參考和應(yīng)用基礎(chǔ)，并為防止蜜蜂飛逃提供支撐[12,13]。

致謝

在此感謝中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園化學(xué)生態(tài)組提供的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)蜂群，特別鳴謝化學(xué)生態(tài)組老師和其他師兄師姐的指導(dǎo)和關(guān)心。