蔡 元，田見暉，王 棟，羅玉柱，翁士喬,李春陽

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070；5.寧波三生生物科技有限公司, 寧波 315100)

綿羊(Ovisaries)產(chǎn)羔數(shù)是影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素，產(chǎn)羔數(shù)的增加對(duì)于養(yǎng)羊經(jīng)濟(jì)效益的提高具有重要意義。胚胎產(chǎn)前損失是哺乳動(dòng)物繁殖過程中的一個(gè)主要問題，綿羊和大多數(shù)哺乳動(dòng)物胚胎死亡率約20%～40%，其中三分之二發(fā)生在附植期[1]。目前，尚無有效方法減少早期妊娠胚胎損失，嚴(yán)重制約了家畜繁殖性能的發(fā)揮。母體營養(yǎng)是影響子宮內(nèi)環(huán)境的主要因素，在調(diào)節(jié)胎兒存活、生長和發(fā)育中起重要作用。其中，營養(yǎng)的均衡性和質(zhì)量都可能影響到胚胎發(fā)育。研究表明，精氨酸是體內(nèi)合成一氧化氮(nitric oxide，NO)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的前體，能夠調(diào)控胎盤的營養(yǎng)運(yùn)輸，促進(jìn)胎盤和胎兒發(fā)育[2]，精氨酸通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)合成的NO對(duì)胚胎發(fā)育、著床和滋養(yǎng)層侵入、胎盤血管生成具有積極的調(diào)控作用[3-7]。鑒于精氨酸對(duì)胚胎發(fā)育的重要促進(jìn)機(jī)制，很多研究在飼料中添加N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutamate，NAG)的類似物[8]N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)，以激活精氨酸內(nèi)源合成的必需輔助因子氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ(Carbamyl phosphate synthetase Ⅰ,CPS-Ⅰ)，促進(jìn)精氨酸內(nèi)源合成[9]。通過妊娠飼糧中添加NCG提高了胚胎存活率，顯著改善了母豬繁殖性能[10-11]，NCG還能降低過高血漿氨導(dǎo)致的胚胎和胎兒死亡風(fēng)險(xiǎn)[12]。有研究曾對(duì)限飼母羊補(bǔ)飼NCG，使胎盤肉阜和子葉組織中Tie-2 mRNA表達(dá)量、p-p70S6K蛋白表達(dá)量和臍靜脈血中的NO濃度顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)了胎盤生長發(fā)育[13]，NCG添加還促進(jìn)了營養(yǎng)不良母羊的胎兒生長[14-15]，但目前還未見母羊妊娠早期飼喂NCG效果的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究擬在經(jīng)產(chǎn)母羊妊娠早期飼糧中添加不同水平NCG，探索其對(duì)產(chǎn)羔性能的影響，以期為提高養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟(jì)效益提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

NCG的有效含量為97%，由國家飼料工程技術(shù)研究中心生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇160只2～3歲、胎次(2～3胎)和體重相近(約60 kg)、繁殖機(jī)能正常的湖羊母羊，隨機(jī)分為4組， 每組40只，每只母羊?yàn)?個(gè)重復(fù)。參照NRC(2004)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)相應(yīng)體重母綿羊妊娠前期營養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)飼糧(表1)。精料和粗飼料混合飼喂，對(duì)照組每只羊每天飼喂2.7 kg，其中精料0.162 kg、大麥草0.621 kg、苜蓿草0.135 kg、玉米青貯1.782 kg。以飼喂基礎(chǔ)飼糧的為對(duì)照組，飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.05%、0.08%和0.11%NCG的為試驗(yàn)組。配種公羊?yàn)榘闹薨?，母羊采用同期排?子宮角定時(shí)輸精方式配種，腹腔鏡子宮角輸精1次，自配種當(dāng)天(計(jì)為妊娠第0天)開始進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，飼喂40 d后，各組均飼喂基礎(chǔ)飼糧，直到分娩。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets (dry matter basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理及樣品采集

試驗(yàn)在甘肅武威普康集團(tuán)進(jìn)行。各組根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼喂日糧，每天分08:30和16:00兩次飼喂。保證舍內(nèi)清潔干燥、通風(fēng)良好、溫度適宜，并進(jìn)行常規(guī)清潔和定時(shí)消毒。在妊娠第0、20、40天上午8:00，每組選擇10只母羊空腹頸靜脈采血10 mL，置于有肝素鈉的離心管內(nèi)，混勻，靜置20 min，4 ℃ 3 000×g離心10 min分離血漿樣品，將血漿分裝于1 mL的離心管，-20 ℃凍存，用于測定血漿中氨基酸、尿素、TNOS、iNOS、NO、生長激素、雌二醇、孕酮和氨的濃度。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 母羊產(chǎn)羔性能 記錄窩產(chǎn)羔羊數(shù)、窩產(chǎn)活羔數(shù)、死羔數(shù)、羔羊初生重等指標(biāo)。

1.4.2 血漿氨基酸濃度的測定 采用德國賽卡姆Sykam(S-433D)(德國賽卡姆公司)氨基酸自動(dòng)分析儀，測定血漿氨基酸濃度。取0.5 mL血漿樣品與10%磺基水楊酸按1∶3 比例稀釋，高速振蕩1 min， 冰上靜置 15 min，4 ℃ 10 000×g離心15 min， 取上清液過濾裝瓶,上機(jī)測定氨基酸濃度。

1.4.3 血漿TNOS、iNOS、NO、氨、尿素、生長激素、雌二醇和孕酮濃度的測定 用比色法測定TNOS、iNOS、NO、尿素和氨的濃度，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定生長激素、雌二醇和孕酮濃度，均按試劑盒操作說明進(jìn)行各指標(biāo)測定。TNOS、iNOS、NO和氨試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；尿素、生長激素、雌二醇和孕酮檢測試劑盒均購自江蘇寶萊生物科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理

剔除試驗(yàn)期間掉栓、返情、空懷的試驗(yàn)羊，4個(gè)處理組實(shí)際分娩母羊的數(shù)量分別為22、21、22和22只。 用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊產(chǎn)羔性能的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，添加0.08%和0.11%NCG組，母羊窩產(chǎn)羔分別提高0.64(P<0.05)和0.59只(P<0.05)；窩產(chǎn)活羔數(shù)分別提高0.59(P<0.05) 和0.68只(P<0.05)；活羔初生個(gè)體重分別減少0.73(P<0.05)和0.78 kg(P<0.05)，但活羔初生窩重提高不顯著(P>0.05)。對(duì)照組2只母羊各產(chǎn)1只死胎，0.08%NCG組1只母羊產(chǎn)3只死胎。說明妊娠早期添加0.08%和0.11%NCG，能顯著增加湖羊窩產(chǎn)羔數(shù)，改善湖羊產(chǎn)羔性能。

表2 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊產(chǎn)羔性能的影響Table 2 Effects of different dietary NCG supplementation on the lambing performance of ewes during early pregnancy

2.2 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿游離氨基酸濃度的影響

如表3所示，添加NCG對(duì)妊娠20和40 d母羊血漿游離氨基酸濃度影響不顯著(P>0.05)，但血漿精氨酸濃度隨NCG增加呈逐漸升高趨勢;妊娠40 d時(shí)，血漿脯氨酸濃度隨NCG添加量增加呈升高趨勢。說明綿羊妊娠早期飼糧中添加NCG后血漿精氨酸和脯氨酸濃度有逐漸升高趨勢。

表3 妊娠早期飼糧中添加NCG 對(duì)母羊血漿游離氨基酸濃度的影響Table 3 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentration of free amino acids in plasma of ewes during early pregnancy mol·L-1

2.3 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿NO、TNOS、iNOS濃度的影響

如表4所示，妊娠第40天時(shí)，0.05%、0.08%和0.11%NCG組NO濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，各添加組間差異不顯著(P>0.05)；0.05%、0.08%和0.11%NCG組TNOS濃度比對(duì)照組高，但差異不顯著(P>0.05)；0.11%NCG 組的iNOS濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加0.11%NCG，能夠顯著增加妊娠第40天綿羊血漿NO和iNOS的濃度。

表4 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿NO、TNOS、iNOS濃度的影響Table 4 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of NO，TNOS and iNOS in plasma of ewes during early pregnancy

2.4 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿激素濃度的影響

如表5所示，添加NCG對(duì)生長激素和雌二醇影響不顯著(P>0.05)； 0.11%NCG組妊娠第20天孕酮濃度比對(duì)照組高223.41 pmol·L-1(P<0.05)，其余各組間孕酮濃度差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加0.11%NCG，能夠顯著增加妊娠第20天綿羊血漿孕酮的濃度。

表5 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿激素濃度的影響Table 5 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of hormone in plasma of ewes during early pre-gnancy

2.5 妊娠早期飼糧中添加NCG對(duì)母羊血漿尿素和氨濃度的影響

如表6所示，添加NCG對(duì)血漿尿素濃度影響不顯著(P>0.05)，0.08%和0.11%NCG組，妊娠第20天氨濃度顯著低于對(duì)照組和0.05%NCG組(P<0.05)，0.11%NCG組妊娠第40天血氨濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加NCG，能夠顯著降低妊娠第20天0.08%和0.11%NCG組及妊娠第40天0.11%NCG組綿羊血漿氨的濃度。

表6 妊娠早期飼糧中添加NCG 對(duì)母羊血漿尿素和氨濃度的影響Table 6 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of urea and ammonia in plasma of ewes during early pregnancy

3 討 論

3.1 添加NCG對(duì)母羊產(chǎn)羔性能的影響

本研究表明，妊娠早期添加NCG，能增加母羊窩產(chǎn)羔數(shù)、窩產(chǎn)活羔數(shù)，改善湖羊產(chǎn)羔性能。母體營養(yǎng)是影響子宮內(nèi)環(huán)境最主要的因素，母體營養(yǎng)不足和營養(yǎng)過剩都會(huì)降低胎盤-胎兒血流量，影響胎兒的生長發(fā)育和存活[16]，尤其在著床期和胎盤發(fā)育期，胎兒發(fā)育最容易受到蛋白質(zhì)缺乏的影響，適宜的營養(yǎng)是提高胚胎存活率和促進(jìn)胎兒生長發(fā)育的首要因素[10,17]。NCG作為精氨酸內(nèi)源合成關(guān)鍵酶CPS-Ⅰ的激活劑，在體內(nèi)能促進(jìn)精氨酸合成，在動(dòng)物機(jī)體中發(fā)揮多種有益作用，如促進(jìn)血管生成、改善氮代謝、促進(jìn)泌乳和生長、增強(qiáng)動(dòng)物繁殖和免疫能力[18]，尤其是能促進(jìn)綿羊滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞系增殖、遷移和蛋白質(zhì)合成[19-20]，減少多胎母羊胚胎損失，增加羔羊出生體重，提高胎羔成活率[21-22]。經(jīng)產(chǎn)母豬整個(gè)妊娠期飼糧添加0.1%NCG，窩產(chǎn)活仔數(shù)提高0.55頭，仔豬初生窩重提高1.39 kg，初生個(gè)體重提高70 g，90 d血漿脯氨酸濃度顯著升高[12]，妊娠早期母豬飼糧添加NCG，顯著增加了窩產(chǎn)活仔數(shù)[11]。本試驗(yàn)首次在湖羊妊娠早期添加NCG，也顯著改善了母羊產(chǎn)羔性能。

此外，本研究中添加NCG雖然提高了窩重，但0.08%和0.11%NCG組活羔初生個(gè)體重顯著降低，主要原因是添加NCG使產(chǎn)羔數(shù)顯著增加,由于總營養(yǎng)的限制性和個(gè)體的營養(yǎng)競爭作用，導(dǎo)致活羔初生個(gè)體重顯著降低；同時(shí)，經(jīng)產(chǎn)母豬中一般在整個(gè)妊娠期[12]或妊娠后期[23]添加NCG，增加了仔豬數(shù)量，促進(jìn)了胎兒的發(fā)育，本研究為減少早期妊娠胚胎損失，提高綿羊的產(chǎn)羔性能，在妊娠早期添加NCG，活羔初生個(gè)體重在3.6 kg以上，達(dá)到了一般羊場羔羊初生重為1.8 kg以上的健康標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 添加NCG對(duì)母羊血漿NO和iNOS濃度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，0.05%、0.08%、0.11%NCG組在妊娠第40天時(shí)血漿NO顯著升高，有研究報(bào)道，添加NCG提高了妊娠母豬血漿NO含量[2, 12, 23]，限飼母羊補(bǔ)飼0.1%NCG使臍靜脈血中的NO濃度顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)了胎盤生長發(fā)育[13]，和本研究結(jié)果一致。動(dòng)物體內(nèi)的NO是由精氨酸在NOS參與下合成[3]，NO是一種重要的內(nèi)皮源性舒張因子，通過調(diào)控胎盤-胎兒間血流，在母體向胎兒提供養(yǎng)分和氧氣的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[24]，還通過重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)胚胎著床[25]，為胎兒在子宮中的發(fā)育提供大量營養(yǎng)素[26]，在胎盤血管發(fā)育中起重要作用[4]，血管生成的起始需要VEGF的表達(dá)[27]，其有絲分裂效應(yīng)由NO介導(dǎo)[28-29]，NO可誘導(dǎo)來自不同血管床的胎兒內(nèi)皮細(xì)胞增殖[30-31]，并調(diào)節(jié)中心血管口徑[32]。大量的證據(jù)表明，NO是胎盤血管生成、胚胎發(fā)育以及胎盤和胎兒生長的重要調(diào)控因子[27-32]。妊娠早期NO濃度升高促進(jìn)了胎盤發(fā)育，同時(shí)也提高了胚胎的存活和著床率，這可能是妊娠早期添加NCG增加綿羊產(chǎn)羔數(shù)的作用機(jī)理。妊娠0～28 d的母豬飼糧添加NCG，促進(jìn)了胚胎存活和發(fā)育，使妊娠第28天的總胎和活胎數(shù)顯著增加，死亡率顯著降低[10]，這一結(jié)果支持了本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)增加作用機(jī)理的推測。此外，Liu等[33]研究表明，NCG可能通過microRNAs調(diào)控NOS和血管內(nèi)皮生長因子等活性，這進(jìn)一步印證了本試驗(yàn)中添加NCG提高iNOS濃度的結(jié)果，也為本研究結(jié)果給出了科學(xué)合理的解釋。

3.3 添加NCG對(duì)母羊血漿激素水平的影響

雌激素和孕激素是調(diào)控妊娠的主要激素，它們在卵細(xì)胞的生殖道轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化、子宮內(nèi)皮細(xì)胞蛻膜化以及在胚胎著床過程中，都扮演著重要的調(diào)控角色，對(duì)哺乳動(dòng)物妊娠的建立和維持起著至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)在妊娠早期飼糧中添加NCG，提高了妊娠第20天的血液孕酮濃度，尤其0.11%NCG組在妊娠第20天的血漿孕酮顯著增加，因精氨酸也是一種激素促分泌素，能夠促進(jìn)胰島素、生長激素等激素的合成與分泌[26, 34]。妊娠初期，孕激素能促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，使腺體發(fā)育、功能增強(qiáng)，從而有利于胚胎附植[35]，此階段孕酮濃度的升高，可能也是添加NCG增加產(chǎn)羔數(shù)的原因之一。

3.4 添加NCG對(duì)母羊血漿氨濃度的影響

經(jīng)產(chǎn)母豬整個(gè)妊娠期飼糧中添加0.1%NCG后，血漿尿素和氨濃度降低[12]，本試驗(yàn)中添加NCG組母羊血漿尿素濃度沒有明顯變化，其原因可能是物種不同。在飼糧中添加NCG能夠提高中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量、顯著增加血漿NO水平、降低血漿氨水平、提高氮的利用率[36]。在人類醫(yī)學(xué)中，NCG已被應(yīng)用于臨床進(jìn)行代謝疾病的治療，用NCG處理后，血漿氨和谷氨酰胺水平明顯降低[37]，血漿氨濃度降低有利于胚胎和胎兒的存活[12]。本試驗(yàn)中添加NCG也降低了母羊血漿氨濃度，說明綿羊飼糧中添加NCG提高了氮的利用率，也為胎兒提供了更安全的發(fā)育環(huán)境。

4 結(jié) 論

妊娠早期母羊飼糧添加NCG可提高母羊體循環(huán)iNOS、NO和孕酮濃度，改善胎盤營養(yǎng)與妊娠維持狀態(tài)；降低血漿氨濃度，提高胎兒發(fā)育環(huán)境安全性，改善母羊產(chǎn)羔性能，提高母羊窩產(chǎn)羔數(shù)和窩產(chǎn)活羔數(shù)。