李秋平，霍麗靜，張雪麗，幺建立，錢宇，趙運(yùn)勝，張麗娜，楊丹丹

1秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000；2河北省人民醫(yī)院；3秦皇島市第三醫(yī)院

WHO最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)的結(jié)核病發(fā)病率高達(dá)9%，耐藥結(jié)核病高達(dá)14%。非結(jié)核分枝桿菌（NTM）廣泛存在于自然界中，屬條件致病菌；其所致疾病與結(jié)核病癥狀相似，但治療不同。目前，缺乏準(zhǔn)確和快速診斷仍然是我國(guó)結(jié)核病管理工作中的主要問(wèn)題［1］。結(jié)核分枝桿菌（MTB）培養(yǎng)雖然特異性較高，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，嚴(yán)重影響臨床治療及患者預(yù)后；抗酸涂片鏡檢快速簡(jiǎn)便，但靈敏度、準(zhǔn)確度均較低。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的分子診斷技術(shù)被用于結(jié)核病診斷。GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱Xpert）是一種核酸擴(kuò)增技術(shù)［2］，具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)［3］。盡管2017年Xpert已被WHO認(rèn)可，但我國(guó)尚未正式將其納入到常規(guī)結(jié)核病診斷和管理中［4］。目前，Xpert在國(guó)內(nèi)已開始有相關(guān)報(bào)道，但鮮見其與抗酸涂片鏡聯(lián)合檢測(cè)的研究，本文探討了兩者聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7月—2020年4月于秦皇島市第一醫(yī)院就診的疑似結(jié)核病患者638例，男394例，女244例；年齡12～103歲，其中青年112例、中年156例、老年370例；共收集標(biāo)本638份，其中肺泡灌洗液264份、痰液211份、組織液81份、胸腹水48份、尿液14份、腦脊液13份、膿液7份；經(jīng)MTB培養(yǎng)結(jié)果鑒定，陽(yáng)性252份、陰性386份。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 MTB快速檢測(cè)方法 所有標(biāo)本同時(shí)行抗酸涂片鏡檢及Xpert檢測(cè)，均在二級(jí)生物安全柜內(nèi)完成。采用美國(guó)Cepheid公司Xpert檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)試劑盒，按其操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)；抗酸涂片染色采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的抗酸染色液試劑盒，按照《痰涂片鏡檢與標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》中的操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)，用Olympus光學(xué)顯微鏡鏡檢。聯(lián)合檢測(cè)用平行試驗(yàn)（并聯(lián)試驗(yàn)），凡有一項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性即判為陽(yáng)性，全部結(jié)果均陰性才為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。以MTB培養(yǎng)結(jié)果為參考，評(píng)價(jià)Xpert、抗酸涂片鏡檢單獨(dú)與聯(lián)合的診斷價(jià)值；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分析三種方法與MTB培養(yǎng)結(jié)果診斷的一致性，Kappa≥0.75表示一致性較好、0.4～＜0.75表示一致性一般、＜0.4表示一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 Xpert檢測(cè)與抗酸涂片鏡檢結(jié)果 Xpert檢測(cè)陽(yáng)性245份（MTB培養(yǎng)陽(yáng)性232份、陰性13份），陰性393份（MTB培養(yǎng)陽(yáng)性20份、陰性373份）；抗酸涂片鏡檢陽(yáng)性86份（MTB培養(yǎng)陽(yáng)性62份、陰性24份），陰性552份（MTB培養(yǎng)陽(yáng)性190份、陰性362份）。

2.2 Xpert檢測(cè)、抗酸涂片鏡檢單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)診斷效能比較 Xpert檢測(cè)、抗酸涂片鏡檢與Xpert聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均高于抗酸涂片單獨(dú)檢測(cè)（P均＜0.05），聯(lián)合檢測(cè)與Xpert單獨(dú)檢測(cè)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Xpert檢測(cè)、抗酸涂片鏡檢單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)的約登指數(shù)分別為88.7、18.4、91.3，與 MTB培養(yǎng)結(jié)果診斷的一致性Kappa分別為0.891、0.208、0.909，聯(lián)合檢測(cè)的約登指數(shù)、Kappa值均高于單獨(dú)檢測(cè)。見表1。

表1 Xpert檢測(cè)、抗酸涂片鏡檢單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷效能

3 討論

結(jié)核病作為我國(guó)重大傳染病之一，一直危害著人類的健康。近年來(lái)，我國(guó)新發(fā)的耐藥肺結(jié)核每年約12萬(wàn)例，與普通肺結(jié)核相比，耐藥結(jié)核病傳染性高、治愈率低、治療時(shí)間長(zhǎng)，給結(jié)核病的防控工作帶來(lái)新的挑戰(zhàn)［2］。一線抗結(jié)核藥物治療中，利福平耐藥是治療失敗的主要原因，且MTB極易對(duì)利福平耐藥，一旦出現(xiàn)利福平耐藥會(huì)給臨床治療帶來(lái)困難［5］。因此，快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核病，對(duì)降低結(jié)核病病死率，改善患者預(yù)后，節(jié)約醫(yī)療資源，降低傳播風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

目前臨床診斷結(jié)核病主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，包括傳統(tǒng)的抗酸涂片鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏鑒定實(shí)驗(yàn)?？顾嵬科R檢對(duì)菌量要求高，靈敏度低，要求菌量達(dá)（5～10）×103/mL才能檢出，因此涂片鏡檢陽(yáng)性檢出率僅30%左右，尤其是腦脊液、胸腹水等無(wú)菌標(biāo)本更易漏診；而且，該方法不能區(qū)分MTB和NTM，尤其近幾年來(lái)NTM比例有上升趨勢(shì)，因此該法對(duì)結(jié)核病的診斷會(huì)造成一定困擾；另外，該法不能區(qū)分死菌和活菌，不利于疾病的治療及預(yù)后判斷。MTB培養(yǎng)及藥敏鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)（傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏需要8周，MGIT液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)至少需要5周），對(duì)送檢樣本的時(shí)間、容器等質(zhì)量要求較高，且必須是活菌，操作繁瑣，對(duì)生物安全要求較高。因此，以上兩種方法均不能滿足臨床快速診斷的需求，尋找一種高靈敏度和高特異度的檢測(cè)方法迫在眉睫［6］。

Xpert檢測(cè)技術(shù)是近年新興的分子診斷方法，其采用全自動(dòng)熒光定量PCR技術(shù)，將約2 mL檢測(cè)標(biāo)本置入試劑盒中，樣品自動(dòng)前處理釋放出MTB DNA，自動(dòng)擴(kuò)增檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了真正的封閉系統(tǒng)，樣品盒和儀器之間不存在濕式接觸，擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，適用于多種類型的標(biāo)本檢測(cè)，且消除了污染。該技術(shù)通過(guò)對(duì)MTB特有的rpo B基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和探針（探針A、B、C、D、E）以獲得檢測(cè)結(jié)果，具有較高的靈敏度和特異度。由于95%利福平耐藥菌株均由rpo B基因突變（81 bp的核心區(qū)域RRDR）造成，因此該方法可在2 h內(nèi)完成對(duì)MTB和利福平的耐藥性測(cè)定［7-9］。本研究共252例患者確診結(jié)核病，Xpert檢測(cè)的靈敏度為92.1%、特異度為96.6%、準(zhǔn)確度為94.8%，均明顯高于抗酸涂片鏡檢，且與MTB培養(yǎng)具有較高的一致性，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的靈敏度和特異度較接近。這說(shuō)明Xpert檢測(cè)技術(shù)可以幫助臨床精準(zhǔn)快速診斷結(jié)核病，減少一定的誤診率和漏診率［9-10］。

Xpert檢測(cè)技術(shù)作為一個(gè)獨(dú)立的PCR檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全和環(huán)境要求相對(duì)較低，對(duì)生物安全防護(hù)級(jí)別要求與抗酸涂片鏡檢相當(dāng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求也較低［11］。本研究將這兩種快速檢測(cè)方法進(jìn)行了聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)較抗酸涂片單獨(dú)檢測(cè)明顯提高，較Xpert單獨(dú)檢測(cè)有所提高但差異不顯著。分析其原因可能是Xpert自身已經(jīng)具有較高的靈敏度和特異度，理想狀態(tài)的靈敏度和特異度是100%，而Xpert已經(jīng)達(dá)到92.1%和96.6%，可提升的空間已經(jīng)很小，所以聯(lián)合檢測(cè)并沒有顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也證明了Xpert確實(shí)是一種快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核病的較好方法。另外，本研究?jī)H對(duì)252例結(jié)核病患者進(jìn)行了初步研究，確切的結(jié)論有待于后續(xù)多中心、大樣本量的統(tǒng)計(jì)分析。由于Xpert對(duì)MTB有特異性，對(duì)NTM無(wú)特異性，因此聯(lián)合檢測(cè)時(shí)抗酸涂片鏡檢陽(yáng)性同時(shí)Xpert陰性者，理論上高度懷疑NTM感染，同時(shí)Xpert陽(yáng)性基本可排除NTM感染［12］。有報(bào)道顯示，抗酸涂片鏡檢陽(yáng)性Xpert陰性與培養(yǎng)診斷NTM有較高的一致性，可早期篩檢出90%以上的NTM患者，提高了診斷的時(shí)效性［13］。因此，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)輔助診斷NTM具有一定意義。

Xpert作為一個(gè)高靈敏度、高特異度的分子診斷技術(shù)，在早期診斷結(jié)核病的領(lǐng)域?qū)⒃阶咴綇V，已經(jīng)被應(yīng)用到診斷各類結(jié)核病中，常聯(lián)合超聲、CT、病理等方法診斷骨結(jié)核、腸結(jié)核、胸膜結(jié)核等。另外，有研究報(bào)道Xpert對(duì)利福平的耐藥也能快速檢測(cè)出來(lái)，優(yōu)于傳統(tǒng)的方法，因此Xpert在檢測(cè)利福平耐藥方面的臨床價(jià)值更高［14］。同時(shí)《兒童結(jié)核病管理指南》推薦Xpert用于診斷兒童結(jié)核病，針對(duì)兒童疑似結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病以及兒童結(jié)核性腦膜炎腦脊液的檢測(cè)，Xpert可先于傳統(tǒng)方法（涂片、培養(yǎng)）作為初篩實(shí)驗(yàn)使用［15］。

綜上所述，Xpert診斷結(jié)核病具有較高的靈敏度和特異度，明顯優(yōu)于單獨(dú)抗酸涂片鏡檢；Xpert聯(lián)合抗酸涂片檢測(cè)沒有明顯提高Xpert的診斷效能，但對(duì)NTM輔助診斷可能具有一定意義。