肖毅力，張寶月，張亞紅，宋正己

1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；2云南省第一人民醫(yī)院

肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程，是各種慢性肝病損傷修復(fù)過程的共同結(jié)果，并與肝癌的發(fā)生有關(guān)。肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素是肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖和活化［1］，活化的HSC是肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要來源［2］，對HSC增殖與活化的抑制一直是抗肝纖維化研究的核心。在慢性肝損傷時(shí)，HSC激活表型轉(zhuǎn)化為表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）［3］。HSC的活化由許多炎癥細(xì)胞因子和生長因子介導(dǎo)，包括結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）。TGF-β1是從HSC產(chǎn)生ECM的主要刺激物，且在纖維發(fā)生過程中表達(dá)增加［4-5］。此外，研究表明，持續(xù)的 Wnt/βcatenin通路激活與肺臟、肝臟、腎臟及皮膚纖維化等的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［6］。Frizzled-4是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵受體蛋白，F(xiàn)rizzled-4的表達(dá)量直接影響細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平，β-catenin的核內(nèi)累積是Wnt信號通路活化的重要標(biāo)志［7］。靈芝是中國傳統(tǒng)藥物，具有抗腫瘤、抗氧化、保肝等作用；白靈芝屬于靈芝的一種，為中國西南地區(qū)特有品種。2017年6月—2019年2月，我們觀察了白靈芝提取物（GLE）對大鼠HSC增殖、活化的影響，并探討其是否與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，以期為防治肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 GLE由云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，于-20℃冰箱保存；大鼠HSC-T6購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫。青霉素—鏈霉素雙抗（BI公司），CCK8（碧云天），特級胎牛血清（美國GIBCO），DMEM高糖培養(yǎng)基（BI公司）；一抗GAPDH、Frizzled-4、β-catenin抗體（英國Abcam），二抗兔抗兔（CELL SIGNALING），SDSPAGE凝膠試劑盒（碧云天），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），Chemidoc XRS成像系統(tǒng)（BIORAD），Trans-blot電泳槽組件（BIO-RAD）；SYBR熒光染料試劑盒（TAKALA公司），總RNA提取試劑盒（天根），Master Mix（TAKALA）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Aglient），超微核酸定量檢測儀（BIO-TEK）。

1.2 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的HSC-T6接種于含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代備用。在生物安全柜中用胰酶消化HSC-T6，用培養(yǎng)基配成5×105/mL的細(xì)胞懸液；將HSC懸液接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL；輕搖培養(yǎng)板以保證鋪板均勻，將鋪好的96孔板于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3 GLE溶液制備 臨用前夜將GLE轉(zhuǎn)入4℃冰箱緩慢解凍，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋5倍；以0.22 μm微孔濾器過濾后，繼續(xù)用上述培養(yǎng)基分別稀釋10、25、50、100、200倍備用。

1.4 HSC-T6細(xì)胞增殖情況觀察及GLE作用時(shí)間、濃度篩選 在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，吸出孔板中的培養(yǎng)基；GLE組將稀釋好的GLE加入96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)濃度均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；對照組加100 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。左右輕微搖晃后，將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL，在37℃恒溫箱孵育2～4 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔OD值，各復(fù)孔OD值取平均數(shù)，以此表示細(xì)胞增殖情況；OD值越小，則抑制作用越強(qiáng)；選擇與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的干預(yù)時(shí)間，作為后續(xù)研究的作用時(shí)間。根據(jù)藥物各濃度組的細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算GLE干預(yù)的半數(shù)抑制濃度（IC50），選擇小于該濃度的GLE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)。增殖抑制率=（對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值）/對照孔OD值×100%。

1.5 HSC-T6細(xì)胞活化情況觀察 將對數(shù)生長期的HSC接種于6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去上清液；干預(yù)組加入1.4篩選濃度的GLE 1.5 mL于6孔板中，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入裂解液RZ，用移液器不斷吸取裂解液并吹打孔板中的細(xì)胞，使細(xì)胞被充分、均勻裂解。根據(jù)總RNA提取試劑盒說明提取RNA備用，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到cDNA，參考試劑盒說明書將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參，按照2－ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列：α-SMA上游為5′-TGGTATTGTGCTGGACTCTG-3′，下游為5′-CCATCAGGCAGTTCGTAG-3′；TGF-β1上游為5′-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3′，下游為5′-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3′；內(nèi)參 GAPDH上游為 5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游為5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。

1.6 HSC-T6細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白檢測 將HSC-T6配置成1×105/mL的細(xì)胞懸液，以每孔1.5 mL接種于6孔板中；待細(xì)胞融合至80%左右，干預(yù)組每孔加入1.4篩選濃度的GLE 1.5 mL，對照組每孔加入等量含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培育48 h。用含有PMSF的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用Western blotting法以GAPDH為內(nèi)參測算β-catenin、Frizzled-4蛋白表達(dá)量，以此表示信號通路活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)比較采用方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLE對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響及作用時(shí)間、濃度篩選結(jié)果 由表1可見，隨著GLE濃度增加及干預(yù)時(shí)間延長，HSC-T6細(xì)胞增殖的OD值逐漸降低；與對照組比較，干預(yù)24 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干預(yù)48、72 h時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），故選擇48 h作為后續(xù)研究的作用時(shí)間。GLE組在稀釋200、100、50、25、10倍時(shí)，干預(yù)24 h的增殖抑制率分別為6.647%、5.766%、6.266%、6.997%、9.690%，干預(yù)48 h的細(xì)胞增殖抑制率分別為28.509%、51.695%、63.139%、65.763%、69.876%，干預(yù)72 h的細(xì)胞增殖抑制率分別為25.676%、43.266%、67.325%、82.339%、82.224%。GLE干預(yù)48 h時(shí)的IC50約為GLE稀釋100倍，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用稀釋200倍為GLE作用濃度。

表1 GLE對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響（）

表1 GLE對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

images/BZ_46_234_1605_1193_1664.png GLE組稀釋10倍稀釋25倍稀釋50倍稀釋100倍稀釋200倍對照組0.414±0.027*0.411±0.062*0.761±0.130*1.321±0.240*1.731±0.150*2.330±0.067 3.007±0.085 3.097±0.078 3.121±0.073 3.183±0.083 3.109±0.012 3.330±0.133 0.945±0.141*1.074±0.024*1.156±0.111*1.515±0.042*2.243±0.253*3.137±0.033

2.2 GLE對HSC-T6細(xì)胞活化的影響 干擾組HSC-T6細(xì)胞α-SMA、TGF-β1mRNA相對表達(dá)量分別為0.77± 0.23、0.86± 0.15，對照組均為1，干擾組α-SMA、TGF-β1mRNA表達(dá)均低于對照組（P均＜0.05）。

2.3 GLE對HSC-T6細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)的影響 干擾組HSC-T6細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白Frizzled-4、β-catenin表達(dá)量分別為0.81±0.13、0.63±0.17，分別低于對照組的0.96± 0.16、0.84 ± 0.22（P均＜0.05）。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷愈合反應(yīng)后的結(jié)果，是一個(gè)損傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程。其特征在于不同因素（病毒、自身免疫、藥物誘導(dǎo)、膽汁淤積和代謝疾病等）引起的慢性肝損傷組織中ECM增多并伴有病理性血管新生［8-9］，可造成門靜脈高壓、肝脾腫大、肝功能紊亂甚至衰竭。慢性肝炎病毒感染和長期接觸有毒物質(zhì)如乙醇等可誘發(fā)肝細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡會(huì)激活靜止HSC，觸發(fā)肝臟修復(fù)機(jī)制使ECM分泌增加，最終導(dǎo)致肝內(nèi)纖維生成和降解失衡，過多的膠原在肝內(nèi)沉積［3，10］。

HSC由靜息變?yōu)榧せ畋硇?，由維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為增殖性、收縮性增加的肌成纖維細(xì)胞，活化HSC現(xiàn)已成為實(shí)驗(yàn)和臨床肝纖維化干預(yù)的主要靶細(xì)胞［11］。在慢性肝損傷期間，HSC激活成表達(dá)α-SMA具有收縮性的肌成纖維細(xì)胞，HSC表型從脂肪儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，脂滴逐漸減少或消失，細(xì)胞增殖和細(xì)胞收縮遷移能力增加，導(dǎo)致肝內(nèi)血管扭曲和血管阻力增加，從而促進(jìn)門靜脈高壓癥形成［12-13］。TGF-β有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33 種同種亞型，是與ECM相關(guān)且研究最深入的細(xì)胞因子之一。TGF-β1是促進(jìn)纖維化的主要因子，能夠通過跨膜受體發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)包括Ⅰ型、Ⅲ型前膠原在內(nèi)的ECM分泌相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄［14］。因此，TGF-β1對HSC的活化作用是肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。在各種因素刺激下（肝炎病毒、乙醇、各種抗原等），TGF-β1/Smads信號通路可激活HSC并促進(jìn)其分泌大量ECM沉積在肝臟［4-5］。另外，有研究表明，TGF-β1能夠介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路的激活［15］，而經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的激活有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞行為的功能。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在HSC的增殖、分化、分裂、遷移和凋亡中起重要作用。該通路的異常激活可誘導(dǎo)肝纖維化，阻斷Wnt/β-catenin信號通路是治療肝纖維化的關(guān)鍵方法之一［16-17］。β-catenin蛋白是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白，在沒有Wnt信號的情況下其會(huì)被磷酸化并降解。然而，當(dāng)Wnt蛋白與Frizzled家族蛋白和單個(gè)跨膜脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LPR）5或6共受體的異二聚體受體復(fù)合物結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致下游蛋白β-catenin抑制復(fù)合體GSK-3、APC、CK1等的合成被抑制，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)大量累積，信號傳達(dá)到細(xì)胞核中與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子（LEF/TCF）結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞生命活動(dòng)［7］。

靈芝為古稱的“九大仙藥”之一，最早的中藥典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中即有收載。靈芝中含有豐富的多糖、三萜類、肽類、核苷生物堿、氨基酸以及多種微量元素，是其產(chǎn)生臨床療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。靈芝及其提取物對多種有毒物質(zhì)、免疫、缺血等因素造成的肝損傷均有抑制作用，在抑制肝纖維化、減輕脂肪肝形成等方面也具有良好的作用趨勢，還有一定的抗腫瘤、抗衰老、降血糖作用［18-19］。白靈芝又名白肉靈芝、玉芝，辛平無毒，主治咳逆上氣，益肺氣，通利口鼻，強(qiáng)志意，安魄。目前，市場上常見的白靈芝有云南白靈芝和西藏白靈芝［20］。朱優(yōu)優(yōu)［21］發(fā)現(xiàn)，白靈芝相較于赤靈芝、云靈芝等其他靈芝品種，具有更高的靈芝多糖含量。靈芝多糖是靈芝最主要的化學(xué)成分之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等多種功效［19］。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，GLE組能不同程度抑制HSC增殖，抑制作用與作用時(shí)間及劑量有關(guān)。在慢性肝損傷期間，HSC激活成表達(dá)α-SMA具有收縮性的肌成纖維細(xì)胞，并分泌TGF-β1。本研究發(fā)現(xiàn)，GLE能在核酸水平下調(diào)α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，表明其對于HSC的活化有一定的抑制作用。TGF-β1對HSC細(xì)胞ECM的分泌和活化有刺激作用，對TGF-β1的抑制能夠減緩肝纖維化的進(jìn)程。此外，GLE還能下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路活化，抑制關(guān)鍵蛋白β-catenin和Frizzled-4的表達(dá)，其對肝纖維化進(jìn)程的抑制可能與此通路的阻斷有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。