馬丙南，朱煒春，林菁，周潔雯，高智群

廣州市第八人民醫(yī)院，廣州510440

隨著預(yù)防人類免疫缺陷病毒（HIV）母嬰傳播工作在全球范圍內(nèi)的推進(jìn)，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法（ART）預(yù)防HIV母嬰傳播的方法逐漸得到普及，規(guī)范執(zhí)行包含ART在內(nèi)的母嬰阻斷措施的HIV感染母親所生新生兒（HIV母嬰阻斷新生兒）感染HIV的概率幾乎為零［1］。由于母嬰垂直傳播感染率逐年下降，宮內(nèi)暴露于HIV和ART但未感染（HEU）兒童的人數(shù)逐漸增多，關(guān)于HIV暴露和母嬰阻斷措施對HEU兒童生長發(fā)育的影響也引起了越來越多的關(guān)注。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，與正常兒童相比，HEU兒童會有體格生長發(fā)育落后和神經(jīng)發(fā)育障礙的高風(fēng)險；體格發(fā)育不良經(jīng)過營養(yǎng)干預(yù)后多可以恢復(fù)到正常，但神經(jīng)發(fā)育障礙如注意力下降、記憶力減退及社交互動行為減少等糾正存在困難。出現(xiàn)這些問題的原因主要認(rèn)為是圍產(chǎn)期暴露于HIV和ART，即生命早期的暴露可能持續(xù)影響了其后續(xù)的生長發(fā)育，但是關(guān)于產(chǎn)生相關(guān)影響的具體作用機(jī)制目前尚不清楚［2-4］。腸道菌群作為菌群—腸—腦軸（MGBA）的重要環(huán)節(jié)，在神經(jīng)發(fā)育、情緒、行為和認(rèn)知過程中起到重要作用［5］。圍產(chǎn)期和新生兒期是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，HIV母嬰阻斷新生兒在此期間出現(xiàn)腸道菌群的異?？赡軙ζ渖窠?jīng)發(fā)育產(chǎn)生長期的影響［6］。本研究通過高通量測序分析HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的構(gòu)成特征，旨在尋找影響HIV母嬰阻斷新生兒神經(jīng)功能發(fā)育的潛在因素，以期發(fā)現(xiàn)HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的干預(yù)靶點(diǎn)和治療方向，為HEU兒童神經(jīng)發(fā)育障礙尋找可行的早期預(yù)防方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究為前瞻性、觀察性研究，選取2019年1月—12月在廣州市第八人民醫(yī)院出生的HIV母嬰阻斷新生兒20例（母嬰阻斷組）及同期與之胎齡及出生體質(zhì)量方面相匹配的健康母親所生新生兒20例（對照組），胎齡及出生體質(zhì)量相匹配的標(biāo)準(zhǔn)為胎齡相差5 d以內(nèi)、體質(zhì)量相差200 g以內(nèi)。母嬰阻斷組納入標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒母親HIV呈陽性，且已規(guī)范接受HIV母嬰阻斷治療，無糖尿病、高血壓、肥胖及慢性感染性疾病等其他基礎(chǔ)性疾?。虎谛律鷥涸诒驹撼錾⒃谏? h內(nèi)開始進(jìn)行預(yù)防性ART；③胎齡≥37周；④出生體質(zhì)量≥2.5 kg。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①母親HIV呈陰性，無糖尿病、高血壓、肥胖及急慢性感染性疾病等基礎(chǔ)性疾??；②順產(chǎn)出生，母乳喂養(yǎng)；③胎齡≥37周；④出生體質(zhì)量≥2.5 kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出生時中、重度窒息；②有發(fā)育畸形或先天性基礎(chǔ)??；③母親分娩前1個月內(nèi)使用過抗生素或腸道微生態(tài)制劑；④新生兒需使用抗生素或腸道微生態(tài)制劑治療。母嬰阻斷組男12例，女8例，胎齡（38.63±0.91）周，出生體質(zhì)量（3 398.00±387.29）g，開奶時間（2.10±0.91）h，母親年齡（29.50±3.59）歲；對照組男9例，女11例，胎齡（38.84±1.10）周，出生體質(zhì)量（3 367.50± 365.12）g，開奶時間（2.23±0.90）h，母親年齡（29.30±3.88）歲。兩組研究對象性別、胎齡、出生體質(zhì)量、開奶時間及母親年齡等基線資料比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過廣州市第八人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會備案審批，新生兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 糞便標(biāo)本采集 兩組研究對象均在出生后的第7天采集新鮮糞便標(biāo)本，采集過程中嚴(yán)格遵循無菌操作。用無菌棉簽剝?nèi)バ迈r糞便表層，避免混入尿液或其他雜物，更換棉簽，挑取內(nèi)層糞便至少1 g，裝入無菌凍存管中。收集后立即置于-20℃冰箱保存，并于24 h內(nèi)轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室，用-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道菌群DNA提取和純化 使用QlAamp DNA Stool Mini Kit提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，使用QubitFluorometer試劑盒（美國Life Technologies公司）檢測DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品完整性。利用Taq酶（上海生工）對選擇區(qū)域（V3～V4區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腸道細(xì)菌16 S高通量測序分析。

1.4 細(xì)菌16 S高通量測序 使用Illumina Hiseq 2500（美國Illumina公司）測序平臺進(jìn)行PE250建庫測序，利用雙末端測序（Pair-end）的方法，每條序列從5′端和3′端各產(chǎn)生250讀長（reads）。將測序獲得的原始數(shù)據(jù)在進(jìn)行分析前對其進(jìn)行剪切及過濾，濾除低質(zhì)量reads，獲得有效數(shù)據(jù)；通過有效數(shù)據(jù)之間的重疊關(guān)系將reads拼接成標(biāo)簽（Tags），進(jìn)一步過濾獲取目標(biāo)片段；按照97%的相似度將Tags聚類成操作分類單元（OTU），與已知物種的16 S數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行OTU物種注釋，從而得到每個樣品的群落組成信息。

1.5 腸道菌群多樣性及相對豐度分析 對樣品群落組成行Alpha多樣性分析，包括Observed Species指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)。上述指數(shù)中可以通過Observed Species指數(shù)及Chao1指數(shù)評估各樣品的物種豐富度，通過Shannon指數(shù)評估各樣品的物種多樣性和均勻度，指數(shù)的值越大代表樣品的多樣性越豐富。對兩組在門、科、屬水平的腸道優(yōu)勢菌群相對豐度進(jìn)行比較，分析其細(xì)菌豐度差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究40份樣品共檢測到2 163 156條高質(zhì)量細(xì)菌序列，其中母嬰阻斷組與對照組各檢測到1 006 231、1 156 925條。所有樣本序列共聚類出522個OTUs，其中母嬰阻斷組及對照組各聚類出388、410個OTUs，兩組共有OTUs為276個。

2.1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較 母嬰阻斷組Observed Species指數(shù)及Chao1指數(shù)均低于對照組（P均＜0.05），兩組Shannon指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較（）

表1 兩組腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較（）

images/BZ_37_1284_471_2243_589.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 95.67±12.29 111.80±18.13 3.293 0.002 129.43±9.54 140.12±11.98 3.122 0.003 1.22±0.50 1.58±0.67 1.926 0.062

2.2 兩組在門水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 兩組腸道菌群的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，這4個菌門的相對豐度之和占所有腸道細(xì)菌豐度的99.13%。母嬰阻斷組擬桿菌門相對豐度低于對照組（P＜0.05），兩組厚壁菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組腸道優(yōu)勢菌群在門水平相對豐度比較（%，）

表2 兩組腸道優(yōu)勢菌群在門水平相對豐度比較（%，）

images/BZ_37_235_1412_2243_1471.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 52.36±17.12 56.32±19.26 0.687 0.496 30.45±12.66 26.76±10.33 1.010 0.319 9.13±3.02 7.56±2.26 1.861 0.070 5.36±1.98 7.01±2.17 2.512 0.016

2.3 兩組在科水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 母嬰阻斷組雙歧桿菌科相對豐度低于對照組（P＜0.05），兩組其他菌科比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 兩組在屬水平腸道優(yōu)勢菌群相對豐度比較 母嬰阻斷組雙歧桿菌屬、梭菌屬相對豐度低于對照組（P均＜0.05），其他菌屬比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表3 兩組腸道優(yōu)勢菌群在科水平相對豐度比較（%，）

表3 兩組腸道優(yōu)勢菌群在科水平相對豐度比較（%，）

images/BZ_37_234_2000_2246_2058.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 32.62±11.33 28.43±9.17 1.286 0.206 25.75±9.54 24.53±8.62 0.424 0.674 12.07±5.74 11.89±5.03 0.106 0.917 10.63±2.86 12.17±3.65 1.485 0.146 6.17±1.62 6.09±2.12 0.134 0.894 4.83±1.26 6.67±1.98 3.506 0.001images/BZ_37_234_2290_2246_2365.png母嬰阻斷組對照組t P 2.62±1.13 3.13±1.37 1.284 0.207 0.05±0.02 0.06±0.03 1.240 0.223 1.58±0.62 1.52±0.55 0.324 0.748 1.48±0.31 1.61±0.22 1.529 0.134 1.03±0.42 1.20±0.55 1.099 0.279 0.06±0.02 0.05±0.02 1.581 0.122

表4 兩組腸道優(yōu)勢菌群在屬水平相對豐度比較（%）

表4 兩組腸道優(yōu)勢菌群在屬水平相對豐度比較（%）

images/BZ_37_234_2676_2246_2734.png母嬰阻斷組對照組20 20 t P 28.91±12.26 30.36±13.52 0.355 0.724 25.49±10.47 23.65±11.23 0.536 0.595 14.77±5.76 12.62±4.67 1.297 0.203 8.64±3.16 7.24±2.75 1.495 0.143 8.15±2.13 10.17±3.19 2.355 0.024 4.73±1.57 6.06±2.16 2.227 0.032images/BZ_37_234_2966_2246_3041.png母嬰阻斷組對照組t P 3.42±1.02 3.97±1.44 1.394 0.172 1.36±0.66 1.28±0.51 0.429 0.670 1.27±0.41 1.33±0.55 0.391 0.698 1.05±0.50 1.11±0.43 0.407 0.686 0.42±0.21 0.37±0.16 0.847 0.402 0.08±0.02 0.07±0.02 1.581 0.122 0.07±0.02 0.08±0.03 1.240 0.223

3 討論

人體的腸道菌群在圍產(chǎn)期和嬰幼兒期逐漸建立和發(fā)育，新生兒早期腸道菌群構(gòu)成受到內(nèi)外多種因素的影響［7］。HIV母嬰阻斷新生兒腸道菌群建立的過程中，主要受到以下三方面影響：①由于HIV感染母親的腸道黏膜免疫屏障受損及通透性增加，會伴隨出現(xiàn)母體腸道菌群失調(diào)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，母體腸道菌群的DNA可以傳遞給胎兒，會直接影響其子代腸道菌群的建立［9］。另外，HIV感染母親孕期多有焦慮、緊張或抑郁等心理波動，這些也會影響其子代腸道菌群的定植。②HIV母嬰阻斷新生兒在宮內(nèi)及新生兒期均伴有ART暴露，目前常用的ART均有線粒體毒性；腸道菌群與線粒體之間存在交互效應(yīng)，線粒體可通過其代謝產(chǎn)物對腸道菌群的定植產(chǎn)生影響［1］。③目前HIV母嬰阻斷新生兒多為選擇性剖宮產(chǎn)出生，生后推薦人工喂養(yǎng)，分娩方式及喂養(yǎng)方式對其道菌群的正常建立也會產(chǎn)生影響［10］。因?yàn)橐陨隙嘀匾蛩氐挠绊懀琀IV母嬰阻斷新生兒的腸道菌群可能有別于正常新生兒。由于腸道菌群與宿主之間存在物質(zhì)及能量等方面的相互作用，可直接或者間接地影響宿主的生理及代謝功能，其中也包括對人體神經(jīng)發(fā)育及功能產(chǎn)生影響［5］。因此，研究HIV母嬰阻斷新生兒早期腸道菌群的特征或可為防治HEU兒童神經(jīng)發(fā)育障礙提供一些新的思路。

本研究通過比較兩組新生兒腸道菌群的Alpha多樣性，發(fā)現(xiàn)母嬰阻斷組Observed Species指數(shù)與Chao1指數(shù)低于對照組，提示母嬰阻斷組新生兒存在一定程度的腸道菌群多樣性降低。胎兒期及出生后早期階段是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，一些重要的神經(jīng)連接會在此時建立；在此期間腸道菌群與人體之間相互作用，通過MGBA影響人體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。若在這些時期發(fā)生腸道菌群紊亂，會影響MGBA的信息交流，改變大腦正常發(fā)育軌跡，導(dǎo)致出現(xiàn)行為模式、認(rèn)知水平、社交行為、探索行為或?qū)W習(xí)能力等方面的不良結(jié)局。研究顯示，腸道菌群減少及多樣性降低幼鼠在成年后會出現(xiàn)認(rèn)知障礙和行為異常，無菌小鼠杏仁體內(nèi)多種基因轉(zhuǎn)錄水平顯著改變，其中許多基因與大腦生理活動如神經(jīng)信號傳遞、神經(jīng)元可塑性及神經(jīng)元代謝等有關(guān)；正常腸道菌群的缺失與中樞神經(jīng)遞質(zhì)和受體的改變直接相關(guān)，菌群的改變會導(dǎo)致機(jī)體行為改變［11］。這提示HIV母嬰阻斷新生兒的腸道菌群多樣性降低可引起其代謝產(chǎn)物或神經(jīng)遞質(zhì)的異常，可能是其日后神經(jīng)發(fā)育障礙及行為異常發(fā)生的原因之一。

本研究結(jié)果顯示，兩組在門水平腸道優(yōu)勢菌群比較，母嬰阻斷組擬桿菌門的相對豐度低于對照組。擬桿菌門是健康人群的優(yōu)勢菌門，其主要作用包括幫助宿主分解多糖、提高營養(yǎng)利用率、保持腸黏膜完整性、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育及維持腸道微生態(tài)平衡等。擬桿菌具備較強(qiáng)的發(fā)酵能力，是腸道分解膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）的關(guān)鍵菌群［12］。SCFAs主要為丁酸、丙酸和乙酸等碳原子數(shù)為1～6個的游離脂肪酸，其既可以提供機(jī)體所需的能量及維持腸道的穩(wěn)定性，也是人體的新型信號分子，腸道菌群可通過產(chǎn)生SCFAs參與人體諸多的生理及病理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs具有神經(jīng)活性，特別是丁酸、乙酸和丙酸，可以經(jīng)過相應(yīng)的受體來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并通過MGBA影響人體神經(jīng)功能［13］。研究顯示，SCFAs能促進(jìn)大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和生長，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)大腦免疫防御功能；無菌小鼠由于缺少SCFAs受體會引起小膠質(zhì)細(xì)胞的缺陷，可導(dǎo)致先天性神經(jīng)免疫應(yīng)答受損，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾?。?4］。此外，SCFAs還可通過G蛋白偶聯(lián)通路起到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用，甚至可通過組蛋白去乙酰化等方式起到表觀遺傳修飾的作用［15］。母嬰阻斷組新生兒擬桿菌門豐度降低，可直接影響其短鏈脂肪酸的生成水平，從而影響其神經(jīng)發(fā)育和功能。

兩組在科及屬水平腸道優(yōu)勢菌群比較顯示，母嬰阻斷組雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬及梭菌屬的相對豐度均低于對照組。雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)新生兒腸道中最豐富的定植菌群，其可以消耗人乳中的復(fù)雜寡糖，為人體提供能量［16］。而HIV母嬰阻斷新生兒大都缺乏母乳喂養(yǎng)，這可能是導(dǎo)致其雙歧桿菌豐度下降的原因之一。雙歧桿菌作為人體腸道中最重要的益生菌之一，除了具有維持腸道菌群平衡、抵抗腸道病原菌定植與入侵及增強(qiáng)腸道上皮屏障功能外，還可以通過其代謝產(chǎn)物直接或間接的對神經(jīng)功能產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，對母嬰分離小鼠補(bǔ)充雙歧桿菌可以有效提高腦干和基底核中去甲腎上腺素水平，逆轉(zhuǎn)其行為異常［17］。雙歧桿菌還可利用谷氨酸鈉合成γ-氨基丁酸（GABA），GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體諸多神經(jīng)生理活動，對維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能有重要的作用［18］。梭菌屬是腸道中發(fā)現(xiàn)的最豐富的菌屬之一，是人體腸道最主要的產(chǎn)丁酸細(xì)菌；其產(chǎn)生的丁酸不僅可為腸細(xì)胞提供能量、抑制炎癥因子釋放及保護(hù)腸黏膜屏障，還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫、影響神經(jīng)細(xì)胞可塑性和影響神經(jīng)發(fā)育的功能［19］。所以，母嬰阻斷組新生兒雙歧桿菌科/屬及梭菌屬的相對豐度降低可能會對其近期及遠(yuǎn)期的神經(jīng)發(fā)育和功能產(chǎn)生影響。

綜上所述，與普通新生兒相比，HIV母嬰阻斷新生兒早期的腸道菌群多樣性降低，擬桿菌門、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬及梭菌屬相對豐度降低，這些差異可能會導(dǎo)致腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或神經(jīng)遞質(zhì)異常，并通過MGBA途徑對HIV母嬰阻斷新生兒的大腦發(fā)育、認(rèn)知水平及行為模式等神經(jīng)發(fā)育過程產(chǎn)生不利影響。應(yīng)用微生態(tài)制劑早期干預(yù)、調(diào)節(jié)腸道菌群，進(jìn)而通過MGBA途徑對中樞神經(jīng)產(chǎn)生影響，有望成為改善HEU兒童神經(jīng)發(fā)育預(yù)后的有效手段之一。因本研究為初步探索性研究，仍存在一定的局限性，比如對腸道菌群的檢測僅選取了一個時間點(diǎn)，未進(jìn)行多時點(diǎn)動態(tài)檢測；對腸道菌群的檢測深度僅至屬分類水平等，后期計(jì)劃加大納入的樣本量、增加檢測的時間點(diǎn)及樣本檢測的深度，以進(jìn)行更加深入的研究。