張蕊，蔣磊，王志賢

安徽省第二人民醫(yī)院，合肥230041

細(xì)胞焦亡是細(xì)胞程序性死亡的一種，是指細(xì)胞 受到某些信號(hào)因子刺激，導(dǎo)致細(xì)胞主動(dòng)消亡的病理生理過程。既往研究認(rèn)為，細(xì)胞焦亡的形成機(jī)制可分為Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典型細(xì)胞焦亡和Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典型細(xì)胞焦亡［1-2］。近年研究顯示，Caspase-3/焦孔素E（GSDME）細(xì)胞焦亡途徑在惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。焦孔素（GSDMs）是一個(gè)具有成孔效應(yīng)的蛋白家族，能影響細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞焦亡。GSDMs可與脂質(zhì)結(jié)合，在細(xì)胞膜形成小孔，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［1］。GSDME是GSDMs家族成員之一，其分子結(jié)構(gòu)由兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域組成，即C-末端抑制結(jié)構(gòu)域和N-末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其中N端具有細(xì)胞毒性。GSDME能夠被活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）剪切，形成具有細(xì)胞成孔作用的片段GSDME-N，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物如乳酸脫氫酶（LDH）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-18等釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［3］。研究表明，細(xì)胞焦亡參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。多柔比星（Dox）是一種蒽環(huán)類抗生素，廣泛用于肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的化療，心臟毒性是其主要不良反應(yīng)［4］。目前，有關(guān)Dox導(dǎo)致心臟毒性的具體分子作用機(jī)制尚不完全清楚。2018年12月—2019年12月，我們觀察了Dox對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2焦亡的影響，探討其心臟毒性作用是否與Caspase-3/GSDME信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 H9c2細(xì)胞（美國ATCC公司），高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；多柔比星（Sigma公司）；DAPI細(xì)胞核染料（江蘇碧云天公司），Cleaved Caspase-3一抗（Cell Signaling Technology公司），GSDME-N一抗（Abcam公司），IL-1β、IL-18一抗（Proteintech公司）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、GSDME siRNA干擾片段（廣州銳博公司），CCK-8檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天公司），LDH試劑盒（江蘇碧云天公司），IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（北京中杉金橋公司）。多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus），PCR儀、Western blotting檢測(cè)裝置（Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 向H9c2細(xì)胞中加入高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。加入胰蛋白酶消化、吹打混勻，種植于6孔板內(nèi)；貼壁生長24 h后，傾去細(xì)胞培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、Dox組、GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組和GSDME干擾組?？瞻讓?duì)照組：加入高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；Dox組：加入4 μmol/L Dox培養(yǎng)8 h；而GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組：轉(zhuǎn)染GSDME siRNA對(duì)照無干擾序列24 h后，加入Dox培養(yǎng)8 h；GSDME干擾組：轉(zhuǎn)染GSDME siRNA 24 h后，加入Dox培養(yǎng)8 h。

1.3 細(xì)胞焦亡情況觀察 采用碘化丙丁（PI）細(xì)胞染色法。收集各組細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定，PBS洗滌。避光條件下，加入PI染色液，室溫染色15 min。傾去PI染色液，避光條件下加入DAPI染色3～5 min，PBS洗滌。熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照，以PI陽性細(xì)胞率表示細(xì)胞焦亡情況。PI陽性細(xì)胞率越高，細(xì)胞焦亡發(fā)生率越高。

1.4 細(xì)胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放情況觀察 收集各組細(xì)胞，離心收集上清液；采用比色法檢測(cè)LDH釋放量，ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-18水平。上酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算LDH釋放量。釋放量=（處理樣品吸光度值-空白對(duì)照吸光度值）/（全部釋放量孔吸光度值-空白對(duì)照吸光度值）×100%。

1.5 細(xì)胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將H9c2細(xì)胞離心后置于1.5 mL的EP管內(nèi)，按照1∶3～1∶5加入細(xì)胞裂解液并充分震蕩裂解；用高速離心機(jī)4℃下以12 000 g離心15 min，收集細(xì)胞上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取40 μg蛋白上樣，行蛋白質(zhì)凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h。加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶5 000），孵育1 h。TPBS洗滌，加入發(fā)光聚合物（ECL）；使用膠片曝光，將圖片掃描后用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以-x±s表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PI陽性細(xì)胞率比較 空白對(duì)照組、Dox組、GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組、GSDME干擾組PI陽性細(xì)胞率分別為10.85%±1.25%、65.50%±8.50%、62.89%±8.89%、30.21%±7.50%，Dox組、GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組＞GSDME干擾組＞空白對(duì)照組（P均＜0.05），Dox組與GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組細(xì)胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較 細(xì)胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量Dox組、GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組＞GSDME干擾組＞空白對(duì)照組（P均＜0.05），Dox組與GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組細(xì)胞LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較（）

表1 各組細(xì)胞LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與Dox組比較，#P＜0.05。

images/BZ_28_234_402_1193_465.png空白對(duì)照組Dox組GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組GSDME干擾組50.80±11.21 85.41±18.20*85.44±20.21*60.12±10.21#10.21±2.50 40.80±8.50*41.00±8.95*15.85±6.21#12.50± 2.59 35.21± 8.60*34.50±10.01*21.21± 7.50#

2.3 各組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，Dox組、GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)均升高（P均＜0.05）；與Dox組比較，GSDME干擾組GSDME-N蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），GSDME轉(zhuǎn)染對(duì)照組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較（-x± s）

3 討論

Dox在有效抗腫瘤過程中，常伴隨嚴(yán)重的心臟毒性。研究發(fā)現(xiàn)，Dox靜脈注射后可迅速分布在心、腎、肝和肺等組織，而心臟組織中藥物的消除半衰期明顯高于其他組織［5］。有效解決Dox長時(shí)間滯留于心臟引發(fā)的心臟毒性，可為臨床合理使用Dox提供參考依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧（ROS）過度產(chǎn)生是Dox造成心臟毒性的重要分子機(jī)制之一。ROS可以通過升高脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，繼而導(dǎo)致心臟毒性［6］。線粒體損傷在Dox誘導(dǎo)的心臟毒性中同樣發(fā)揮重要作用，線粒體損傷可以導(dǎo)致ROS過量產(chǎn)生以及細(xì)胞色素C釋放增多［7］。此外，Dox還可誘導(dǎo)一氧化氮合酶高表達(dá)，釋放一氧化氮，促使心肌功能酶失活，導(dǎo)致心肌損傷［8］。

新近研究表明，細(xì)胞焦亡廣泛參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞焦亡在形成機(jī)制和死亡形態(tài)上不同于以往其他類型細(xì)胞死亡，包括凋亡和細(xì)胞壞死［9-10］。以往文獻(xiàn)證實(shí)，細(xì)胞焦亡以細(xì)胞膜破裂為特征，PI染色劑可以通過破損細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而染色，而凋亡的細(xì)胞膜完整則無法通過，因此本文以細(xì)胞PI染色陽性表示細(xì)胞焦亡情況。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Dox組PI陽性細(xì)胞率升高，表明Dox造成了心肌細(xì)胞焦亡；與Dox組比較，GSDME干擾組PI陽性細(xì)胞率降低，這表明干擾GSDME能有效抑制Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。LDH是活細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含酶之一，在正常生理狀態(tài)下不能透過細(xì)胞膜；當(dāng)靶細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可以釋放至介質(zhì)中。因此，細(xì)胞上清液中LDH含量可以反映細(xì)胞膜破損情況。IL-1β和IL-18是細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)誘導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵因子，其可通過細(xì)胞小孔釋放至細(xì)胞外誘導(dǎo)炎癥風(fēng)暴。因此，細(xì)胞膜外IL-1β和IL-18水平可以反映細(xì)胞損傷以及炎癥狀況。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Dox組細(xì)胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量均增加，表明Dox造成了細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致IL-1β、IL-18釋放，從而誘發(fā)細(xì)胞焦亡；與Dox組比較，GSDME干擾組細(xì)胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量降低，表明干擾GSDME能夠有效抑制Dox造成的細(xì)胞損傷以及炎癥反應(yīng)。

在腫瘤細(xì)胞焦亡中，Caspase-3/GSDME依賴性細(xì)胞焦亡途徑發(fā)揮重要作用。Caspase-3是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，Cleaved Capase-3能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂［11］。GSDME是非經(jīng)典細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白，細(xì)胞高表達(dá)GSDME時(shí)，Cleaved Caspase-3亦可誘導(dǎo) GSDME 依賴的細(xì)胞焦亡［12］。ZHANG等［13］報(bào)道，在肺癌A549細(xì)胞中，紫杉醇和順鉑能激活Caspase-3形成Cleaved Caspase-3，進(jìn)而激活GSDME-N并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。在胃癌細(xì)胞中，Dox能通過激活Caspase-3/GSDME途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡［14］。在乳鼠心肌細(xì)胞中，Dox能通過活化Caspase-3和PARP-1，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［15］。高智明［16］研究發(fā)現(xiàn)，Dox能上調(diào)Cleaved Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大以及細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌損傷。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Dox組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N 及 IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)升高；與Dox組比較，GSDME干擾組GSDME、GSDME-N蛋白表達(dá)顯著降低，但是Caspase-3、Cleaved Caspase-3、IL-18、IL-1β蛋白無顯著變化，這表明Dox是通過GSDME依賴性途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。Caspase-3介導(dǎo)的下游信號(hào)GSDME依賴性細(xì)胞焦亡是獨(dú)立于細(xì)胞凋亡的一種新的死亡方式，通過基因干擾GSDME能夠降低LDH、IL-18和IL-1β釋放，證明Dox能夠通過Caspase-3/GSDME途徑誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞焦亡。

綜上所述，Dox可通過Caspase-3/GSDME途徑誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞焦亡，為Dox用于臨床治療腫瘤患者所引起的心臟毒性提供新的分子作用機(jī)制。后續(xù)研究中我們將通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確Dox誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制。