莫蕊辰，王娓娓，趙磊，牟林茂

1山東中醫(yī)藥大學，濟南250000；2山東省立醫(yī)院

支氣管哮喘是最常見的氣道慢性炎癥性疾病之一，患者發(fā)作時可出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，伴隨反復發(fā)作性的喘息、氣促、胸悶或咳嗽，若診治不及時可產生不可逆性氣道狹窄和氣道重塑，急性發(fā)作甚至危及生命。目前西醫(yī)對支氣管哮喘的主要治療模式為階梯治療方案，根據患者的病情嚴重程度和控制水平選擇相應的治療級別。但該方案中激素的應用對部分患者病情控制效果不佳，且長期應用激素不良反應大，容易產生依賴。中醫(yī)治療支氣管哮喘有完整的辨證論治體系與用藥規(guī)律，并具有一定優(yōu)勢，可以提高支氣管哮喘患者第1秒通氣量和用力肺活量［1］。桔梗是經典的止咳、平喘類藥物，能有效改善和預防支氣管癥狀。但目前研究多集中于對桔梗單體成分作用機制的研究，尚未明確桔梗治療支氣管哮喘的靶點及具體通路。2019年11月—2020年10月，本研究運用網絡藥理學方法挖掘桔梗與支氣管哮喘的相關靶點及通路，探討桔梗治療支氣管哮喘潛在的作用機制，以期為支氣管哮喘中醫(yī)藥臨床用藥提供有價值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 桔?；瘜W成分收集和篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）查詢桔梗，獲得桔梗的有效成分。以口服生物利用度（OB）≥10%、化合物類藥性（DL）≥0.18對桔梗有效成分進行篩選，得到符合條件的化學成分。

1.2 桔梗成分作用靶點收集及可視化網絡圖構建 在有機小分子生物活性數據庫（Pubchem）中輸入篩選后的桔梗有效成分，得到化學成分的部分靶點、表示化學成分結構的Canonical SMILES序列及化學成分的2D/3D結構，剔除既沒有靶點也沒有序列的成分，即得到桔梗的最終有效成分；將得到的部分靶點以人類物種（編號9606）和活性（active）進行進一步篩選。將Pubchem獲得的Canonical SMILES序列輸入Swiss target prediction數據庫進行搜索，以Probability≥0.1為篩選條件，得到部分桔梗靶點。將兩個數據庫中獲得的靶點合并，以uniport ID為標準去重復得到桔梗的最終靶點。將最終靶點導入Cytoscape 3.6.2軟件制作有效成分與相關作用靶點的關系網絡圖，利用軟件的Tools模塊，得到“桔?！行С煞帧饔冒悬c”網絡參數。其中一個靶點Degree值代表了與該靶點直接發(fā)生作用的靶點數目，靶點的Degree值越大，說明該靶點的生物功能越多，其生物學重要性越強。設定Degree值≥3，得到桔梗中發(fā)揮相對重要作用的成分及靶點并對其進行可視化處理。

1.3 支氣管哮喘靶點收集和篩選 將asthma分別輸入治療靶點數據庫（TTD）、Drugbank數據庫、疾病基因綜合數據庫（DisGeNET）、毒性與基因比較數據庫（CTD）、genecards數據庫、在線孟德爾人類遺傳數據庫（OMIM）、GAD數據庫、京都基因和基因組合百科全書（KEGG）獲得各數據庫的支氣管哮喘靶點。將以上數據庫所得結果合并、去重復，獲得支氣管哮喘的已知靶點，檢索時限為2019年12月25日。由于數據庫繁雜，不同數據庫中獲得的基因難以對應，故利用Uniport數據庫進行蛋白—基因名標準化，將蛋白名轉化為基因名。

1.4 桔梗治療支氣管哮喘靶點蛋白質相互作用（PPI）網絡構建 將桔梗靶點與支氣管哮喘靶點取交集、去重復，得到桔梗治療支氣管哮喘的預測靶點。將預測靶點導入STRING數據庫，物種設定為Homo snpiens，獲得桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網絡。將獲取到的結果導入Cytoscape3.6.2軟件中，進行PPI網絡可視化處理，其中網絡節(jié)點即靶點、邊的信息即蛋白質相互作用關系，節(jié)點大小根據Degree值確定，Degree值越大，節(jié)點越大。

1.5 PPI網絡拓撲分析與核心靶點獲取 在Cytoscape3.6.2軟件中利用Tools模塊中的Network Analyzer插件，對桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網絡進行分析，可得到自由度、介數、接近中心性、平均最短路徑長度等拓撲相關參數。利用apps模塊中的cytoHubba插件對PPI網絡進行核心靶點拓撲，得到桔梗映射到支氣管哮喘上的核心靶點網絡圖，其中越關鍵的靶點顏色越紅。

1.6 核心靶點的GO功能富集與KEGG通路分析通過DAVID數據庫將獲取的核心靶點進行GO功能富集分析及KEGG通路分析，以P＜0.05為篩選標準進行升序排列，取排名前10的結果對桔梗治療支氣管哮喘的作用機制進行預測。

2 結果

2.1 桔梗有效成分獲取結果 在TCMSP中共查詢到桔梗有效成分130種，其中符合OB≥10%的成分52種、符合DL≥0.18的成分37種、符合OB≥10%且DL≥0.18的成分22種，符合篩選規(guī)則的22種成分包括刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元等。見表1。

2.2 桔梗成分靶點及可視化網絡圖 在Pubchem中分別輸入篩選后的22個有效成分，其中5個成分有靶點，12個成分有Canonical SMILES序列，10個成分既沒有靶點也沒有序列，得到最終有效成分12個。Pubchem中共獲得3 680個靶點，經篩選獲得212個靶點；Swiss target prediction數據庫中共獲得1 100個靶點，經篩選獲得590個靶點，兩個數據庫靶點合并、去重后共得到311個最終靶點。桔梗中發(fā)揮相對重要作用的成分為刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元、桔梗酸C等；發(fā)揮相對重要作用的靶點分別為 AKR1B10、CYP1B1、CYP1A1、NFKB1、POLB、ALOX5等。桔?！行С煞帧饔冒悬c可視化網絡圖見OSID碼圖1。

表1 桔梗有效成分

2.3 支氣管哮喘靶點獲取結果 將各個數據庫的結果合并、去重復后，共得到1 551個支氣管哮喘靶點。

2.4 桔梗治療支氣管哮喘靶點PPI網絡構建結果將311個桔梗成分靶點與1 551個支氣管哮喘靶點合并、取交集、去重，共得到137個桔梗治療支氣管哮喘靶點。通過STRING數據庫得到桔梗治療支氣管哮喘的PPI網絡，此網絡共包括137個節(jié)點，1 292個邊。桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網絡圖見OSID碼圖2。

2.5 桔梗治療支氣管哮喘核心靶點獲取結果 共篩選出10個桔梗治療支氣管哮喘的核心靶點，包括半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體α（ESR1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、雄性激素受體（AR）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、MMP2、誘導髓系白血病細胞分化蛋白（MCL1）。桔梗治療支氣管哮喘核心靶點網絡圖見OSID碼圖3。

2.6 核心靶點的GO功能富集與KEGG通路分析結果 GO功能富集分析共得到GO條目77個，其中生物過程53個、分子功能13個、細胞組成11個，前10的結果中包含生物過程8個（分別為一氧化氮生物合成過程的正調控、蛋白磷酸化正調控、胚胎植入、平滑肌細胞增殖的陽性調節(jié)、細胞對機械刺激的反應、傷口愈合、對雌二醇的反應、凋亡過程的負調控）、分子功能1個（核相關分子功能）、細胞組成1個（酶的綁定）。KEGG通路分析共得到KEGG通路35條，其中前10的通路依次為癌癥中的蛋白聚糖、癌癥通路、雌激素信號通路、酪氨酸激酶受體家族信號通路、低氧誘導因子1信號通路、磷脂酰三磷酸肌醇—絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、非小細胞癌、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、血管內皮生長因子信號通路。

3 討論

本研究運用網絡藥理學方法預測桔梗治療支氣管哮喘的作用機制，共篩選獲得桔梗治療支氣管哮喘的有效靶點137個，核心靶點10個，GO條目78個，KEGG通路35條。提示桔梗通過一氧化氮生物合成過程的正調控、蛋白磷酸化正調控、平滑肌細胞增殖的陽性調節(jié)等生物過程，以及ErbB、mTOR、HIF-1等信號通路來發(fā)揮對支氣管哮喘的治療作用

本研究對桔?！行С煞帧饔冒悬c的分析顯示，桔梗中的刺槐素、木犀草素可能是治療支氣管哮喘的關鍵成分。刺槐素是從刺槐中提取的一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎的功能，并且可以通過抑制巨噬細胞上TRAIL-R1死亡受體的表達水平來介導細胞凋亡［2］。陳菲菲等［3］認為，刺槐素可能通過抑制維甲酸受體相關孤兒受體γt活化，減少CD4+CD62L+T細胞向Th17細胞分化及IL-17的表達，從而降低中性粒細胞炎癥反應，起到治療支氣管哮喘的作用。LI等［4］研究顯示，刺槐素可通過降低支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子INF-α和IL-2的水平來減輕肺組織病理損傷。木犀草素是從木犀草屬中提取的一種黃酮類化合物，分布較廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗心肌缺血、調節(jié)免疫應答等藥理作用。余潔等［5］研究顯示，木犀草素可以抑制支氣管哮喘患兒外周血單核細胞促炎細胞因子TNF-α、IL-6的分泌，其可能通過作用于TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎效應，對支氣管哮喘具有潛在的治療作用。趙長祺等［6］的實驗顯示，一定濃度（2.5、5、10 mg/L）的木犀草素能夠抑制T淋巴細胞增殖，并誘導T淋巴細胞凋亡，其中10 mg/L木犀草素可能通過下調T淋巴細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、上調促凋亡蛋白Bax的表達來影響線粒體凋亡通路?？姶骒o等［7］認為，木犀草素可以通過下調標志蛋白E-鈣黏素表達，上調波形蛋白表達來逆轉轉化生長因子β1誘導的肺癌A549細胞的上皮—間充質轉化，同時對肺癌細胞的侵襲和轉移有一定的抑制作用。由上可見，桔梗中的刺槐素、木犀草素等有效成分，表現(xiàn)出抗炎、抗腫瘤、調節(jié)免疫應答等作用，可能做為關鍵成分參與到支氣管哮喘的治療中。

本 研 究 結 果 顯 示 ，CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9、MMP2等10個核心靶點在桔梗治療支氣管哮喘中發(fā)揮了重要作用。氣道炎癥、氣道重塑目前被認為是支氣管哮喘本質的病理機制，其中炎癥介質以及細胞凋亡的參與十分重要，而CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9都是參與上述變化的典型因子。CASP3是細胞凋亡的關鍵一環(huán)，當細胞線粒體膜損傷，線粒體內的細胞色素釋放到細胞外，可激活CASP3從而誘導細胞凋亡。同時，CASP3還可通過內質網通路發(fā)揮調控細胞凋亡的作用，參與支氣管哮 喘 氣 道 重 塑 的 過 程［8］。VALLESE 等［9］發(fā) 現(xiàn) ，MAPK3的亞型p38 MAPK在支氣管哮喘患者氣道黏膜下層高度表達，對體外支氣管上皮細胞刺激后，p38 MAPK mRNA升高。其引起氣道炎癥的機制為氣道上皮細胞被刺激后，p38 MAPK活化，可導致炎癥介質IL-8、TNF-α等釋放；p38 MAPK還參與上呼吸道病毒感染引起的炎癥反應，在支氣管哮喘急性加重期起重要作用［10］。研究顯示，p38 MAPK與線粒體細胞凋亡途徑有關，抑制其活化可能減少氣道平滑肌細胞增生，抑制氣道重塑［11］。桔?？赡茏鳛閜38 MAPK抑制劑，通過抑制其活化減少炎癥因子的分泌，對氣道炎癥發(fā)揮作用。此外，EGFR及其配體表達于氣道上皮，調節(jié)氣道上皮修復，參與氣道重塑與氣道黏液高分泌。李曉輝等［12］研究結果顯示，EGFR抑制劑可能通過下調EGFR的表達、抑制依賴于EGFR下游的細胞信號轉導級聯(lián)反應來緩解支氣管哮喘氣道重塑過程。張沄等［13］發(fā)現(xiàn)，許多刺激黏液產生的刺激物通過增加細胞膜表面MMPs來裂解和活化EGFR的上游受體，而EGFR的表達與氣道黏液杯狀細胞病理性增生存在正相關性，因此抑制EGFR的表達可以減少黏液高分泌導致的氣道受阻。在MMPs家族中，MMP9是誘導氣道重塑的重要因子，MMP9與其抑制物TIMP1的失衡會導致細胞外基質降解，降解產物在黏膜下層堆積會導致氣道壁增厚，加速氣道重塑過程［14-15］。由上可見，導致氣道炎癥、氣道重塑的CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9等因子，通過誘導細胞凋亡、介導炎癥介質釋放、增加氣道黏液高分泌等過程推動了氣道炎癥反應，影響并加速氣道重塑，且上述因子不僅存在多途徑、多通路介導同一病理變化的情況，還存在相互介導、協(xié)調的關系，構成了復雜的關系網絡。

GO功能富集分析結果顯示，桔梗治療支氣管哮喘主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、蛋白磷酸化正調控、平滑肌細胞增殖的陽性調節(jié)、細胞對機械刺激的反應、凋亡過程的負調控等多個環(huán)節(jié)。KEGG通路富集結果顯示，ErbB信號通路、mTOR信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等可能是桔梗治療支氣管哮喘的關鍵通路。ErbB存在多種配體與靶基因，ErbB信號通路通過EGFR等受體與表皮細胞生長因子、雙向調節(jié)蛋白等配體相結合后，激活MAPK等下游相關基因來調控細胞增殖等活動，而細胞增殖貫穿支氣管哮喘氣道重塑過程的始終。HIF-1是一種氧依賴性轉錄激活因子，主要在缺氧條件下表達。文獻表明，HIF-1信號通路與其他信號通路間存在交叉調節(jié)，同時也是多條信號通路的必經環(huán)節(jié)。王莉等［16］發(fā)現(xiàn)，mTOR、4EBP1、HIF-1、VEGF信號通路在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要協(xié)同作用。上游mTOR信號通路被激活后，HIF-1表達上調，作為HIF-1的下游因子VEGF表達隨之上調，其信號通路也被激活，這一過程使得嗜酸性粒細胞等多種炎癥細胞聚集、浸潤于氣道，引起氣道高反應的同時損傷氣道上皮細胞，且在炎癥刺激下氣道壁血管通透性增加，氣道壁組織充血水腫，氣道變窄，從而加速支氣管哮喘的進展。此外，與細胞增殖、凋亡及氣道重塑有關的PI3K-Akt和MAPK因子在缺氧的條件下，也可成為HIF-1信號通路的上游，激活HIF-1信號通路［17］。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對桔梗治療支氣管哮喘的潛在作用機制進行多成分、多靶點、多通路的分析。桔梗中的有效成分可能通過調控CASP3、MAPK3、EGFR等關鍵靶點作用于mTOR、HIF-1、VEGF等信號通路，整體協(xié)同發(fā)揮抗炎、抑制氣道重塑的作用。由于本研究未對有效成分、作用靶點、信號通路中的各環(huán)節(jié)進行權重，可能會影響網絡構建的精確度，所以獲得的靶點和通路還需要實驗來進一步驗證。