陳紫紅，黃茂坤

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖居世界前列，2019 年全國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量高達(dá)6 450 萬(wàn)噸［1］.在水產(chǎn)加工過(guò)程中出現(xiàn)大量的下腳料，約占魚體質(zhì)量的70%，這些魚頭、魚皮等下腳料含有豐富的膠原蛋白，大多被丟棄，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染［2］.斑點(diǎn)叉尾鮰魚（Channel Catfish）富含蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，具有增強(qiáng)免疫力和降血脂等功效［3］.冷凍魚片是目前絕大多數(shù)鮰魚進(jìn)行初加工的方式，但這種加工方式會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，致使資源浪費(fèi)和生產(chǎn)成本提高［4］.

大量實(shí)驗(yàn)表明，水產(chǎn)品的蛋白含量豐富，其在抑菌、抗氧化以及抗疲勞等方面作用顯著［5-7］.目前常用的提取蛋白方法主要有超聲輔助法、酶法、堿提酸沉法等，其中，堿提酸沉法易于操作且所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，更適用于水產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)［8-10］.

利用蛋白易溶于堿性溶液從而提高蛋白提取率的特點(diǎn)，本研究采用堿提酸沉法提取鮰魚下腳料蛋白，以蛋白提取率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取蛋白的工藝條件，建立提取工藝與鮰魚蛋白提取率之間的數(shù)學(xué)模型，以期獲得最優(yōu)的蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)，旨在為斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的高值化利用及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮斑點(diǎn)叉尾鮰魚購(gòu)于泉州市豐澤區(qū)石頭街菜市場(chǎng)；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸和氫氧化鈉等試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

ME 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PE20 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H1650 型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DS-7510DT 超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）蛋白提取.將鮰魚下腳料進(jìn)行凍干粉碎后，將凍干魚粉按照一定的比例配成溶液，調(diào)節(jié)堿性pH，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間，取出離心，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH 至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測(cè)定蛋白含量.

（2）蛋白含量的測(cè)定.選用凱氏定氮法測(cè)定鮰魚蛋白質(zhì)的含量［11］，選用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗提液中的蛋白質(zhì)含量［12］.

（3）單因素實(shí)驗(yàn).以蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察料液比、堿提pH 和堿提溫度對(duì)鮰魚蛋白提取率的影響，考察各因素影響的顯著性及最優(yōu)水平.

①料液比對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 至10，置于恒溫振蕩器中，在50 ℃下反應(yīng)2 h 后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測(cè)定蛋白含量.

②堿提溫度對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，按照1∶20 的料液比配成提取液，調(diào)節(jié)pH 至10，分別置于恒溫振蕩器中，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下反應(yīng)2 h后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測(cè)定蛋白含量.

③堿提pH 對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，按照1∶20 的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 分別至9、10、11、12、13，置于恒溫振蕩器中，在50 ℃下反應(yīng)2 h 后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測(cè)定蛋白含量.

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素，采用Design-Expert 8.0 軟件的Box-Behnken 方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立各因素及其交互作用與蛋白提取率之間的數(shù)學(xué)模型，探討料液比（A）、堿提pH（B）、堿提溫度（C）及其交互作用對(duì)蛋白提取率的影響，尋找最優(yōu)的蛋白提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1.

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用楊正坤等人［13］的研究方法進(jìn)行牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作.以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得線性回歸方程為y=1.882 9x+0.260 6（R2=0.992 9）.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

文中所有數(shù)據(jù)均取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 7.5 軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）料液比對(duì)于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.料液比對(duì)鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖1 所示.

圖1 料液比對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

由圖1 可知，當(dāng)料液比在1∶10 到1∶20 之間時(shí)，鮰魚蛋白的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比超過(guò)1∶20，蛋白提取率出現(xiàn)大幅降低后趨于平緩的趨勢(shì).當(dāng)料液比低于1∶20 時(shí)，由于反應(yīng)液的濃度較大，分子間作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致分子擴(kuò)散速率較低，影響反應(yīng)液中蛋白質(zhì)的溶出，降低了蛋白提取率［14］.當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，蒸餾水含量的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)形成了一個(gè)水化層，使蛋白質(zhì)顆粒間隔距離增大，影響蛋白質(zhì)的沉淀效果，從而導(dǎo)致蛋白提取率的降低［15］.因此，料液比以1∶20為宜.

（2）堿提溫度對(duì)于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.堿提溫度對(duì)鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖2 所示.由圖2 可知，隨著溫度升高，鮰魚下腳料蛋白提取率也隨之增大，當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì).當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，溫度較低，反應(yīng)速度較慢，隨著溫度的上升，分子間運(yùn)動(dòng)加劇，有效碰撞次數(shù)增多，反應(yīng)速率的提升導(dǎo)致提取率的上升，這與衛(wèi)萍等人［16］的研究結(jié)果是一致的.蛋白提取率在40 ℃時(shí)達(dá)到29.5%的最高值，當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，高溫會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)展開暴露，蛋白質(zhì)變性使提取率下降［17］.因此選取40 ℃為后續(xù)的堿提溫度.

圖2 堿提溫度對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

（3）堿提pH 對(duì)于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.堿提pH 對(duì)鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖3 所示.由圖3 可知，鮰魚下腳料的蛋白提取率隨著堿提pH 的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì).在堿提pH 為11 時(shí)，蛋白提取率高達(dá)65.48%.在堿 提pH 處于9～11 的 范圍時(shí)，提取率隨著堿提pH 的升高而升高，此時(shí)鮰魚蛋白中的負(fù)電荷在堿性條件下使得蛋白分子相互排斥，分散均勻，溶解度提高，致使提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)［18］，當(dāng)堿提pH 過(guò)高時(shí)，強(qiáng)堿會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或者過(guò)度水解，從而使蛋白提取率下降.因此，選取堿提pH為10、11、12 這三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

圖3 堿提pH 對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素的最佳范圍，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)3 因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響鮰魚下腳料的蛋白提取率的3 個(gè)因素：料液比、堿提溫度和堿提pH 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析，響應(yīng)面分析及結(jié)果見表2.

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果見表3.該模型的P值<0.000 1，回歸模型顯示差異顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.305 6，大于0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，可用該模型預(yù)測(cè)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果.模型的一次項(xiàng)和平方項(xiàng)極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明各因素的交互作用對(duì)鮰魚下腳料蛋白提取率影響不顯著.從表中F值可以看出，各因素對(duì)于提取率的影響為堿提pH>溫度>料液比；采用所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.945 4 大于0.9，說(shuō)明該回歸方程的相關(guān)度較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系相對(duì)顯著，斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料蛋白提取后的提取率變化94.54%來(lái)源于所選變量；失擬項(xiàng)P>0.05，表明該回歸方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面，可以使用該模型來(lái)分析響應(yīng)值的變化.

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，采用所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的蛋白提取最優(yōu)工藝條件為料液比為1∶19.13、堿提pH 為11.39、堿提溫度為37.84 ℃，在該條件下預(yù)測(cè)的提取率為84.85%，為適應(yīng)具體操作，調(diào)整條件為料液比1∶20、堿提pH 11.4、堿提溫度38 ℃，驗(yàn)證后的水解度為82%±0.34%，與預(yù)測(cè)值接近，可見該模型可用于實(shí)踐.

3 討論與結(jié)論

利用堿提酸沉法提取動(dòng)物優(yōu)質(zhì)蛋白，耗時(shí)短且操作便捷，是蛋白提取的常用方式.有研究利用堿提酸沉法提取的如鰱魚［19］、羅非魚［20］、鵝肝［21］、磷蝦［22］等的蛋白質(zhì)，并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)蛋白提取影響因素與本試驗(yàn)基本一致，但不同動(dòng)物源蛋白的最優(yōu)提取條件卻不盡相同，如鰱魚的最佳堿提pH 是12.0，而磷蝦的最佳浸提pH 是13.0.出現(xiàn)這種差別的原因可能是不同原料中的蛋白含量和性質(zhì)不同，從而影響蛋白提取條件.

斑點(diǎn)叉尾鮰魚在經(jīng)過(guò)切片加工后產(chǎn)生大量的下腳料被丟棄，綜合利用不充分，造成了環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，也導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的增加.本試驗(yàn)以斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料為研究對(duì)象，蛋白提取率為指標(biāo)，從料液比、堿提pH和堿提溫度三個(gè)方面篩選出了斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料蛋白提取的最佳工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 響應(yīng)面法優(yōu)化斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料蛋白提取的工藝參數(shù)，建立了關(guān)于提取率的預(yù)測(cè)模型.結(jié)果表明：各因素對(duì)蛋白提取率的影響依次為堿提pH>堿提溫度>料液比，斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶20、堿提pH 11.4、堿提溫度38 ℃，在此條件下，斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料蛋白質(zhì)提取率高達(dá)82%±0.34%.本提取工藝可為斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的高值化利用及附加產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，為鮰魚的產(chǎn)業(yè)增值提供新的技術(shù)支持.