張 寧，馬 競，武國利

0 引言

缺血后再灌注是急性心肌梗死、缺血性心肌病等重要治療手段，而缺血再灌注引起的心肌細胞損傷嚴重阻礙了其療效[1-2]。因此，減少或抑制缺血再灌注損傷對臨床治療相關(guān)心血管疾病具有重要意義。研究表明，中藥治療心肌缺血再灌注損傷療效顯著，可通過抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過氧化作用、減少炎性細胞浸潤、抑制心肌細胞凋亡等保護心肌細胞損傷[3-5]。風(fēng)輪菜是唇形科風(fēng)輪菜屬植物，黃酮是其主要活性成分，風(fēng)輪菜活性部位具有抗氧化、保護內(nèi)皮細胞的作用[6-7]。研究顯示，miRNA在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，可作為診斷心血管疾病的敏感生物標志物[8]。如抑制miR-30c-2-3p可減輕心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷[9]。在自噬性心肌保護中，Notch1信號通路中miR-702-5p差異表達，其可能在自噬性心肌保護中發(fā)揮重要作用[10]。本實驗通過建立缺氧/復(fù)氧心肌細胞模型，研究風(fēng)輪菜總黃酮聯(lián)合miR-702-5p對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細胞H9c2購自美國ATCC細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；P21(貨號：bs-10129R-1)、Caspase-3抗體(貨號：bs-0081R-1)購自上海恒斐生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP(貨號：F030212-EBU)購自北京百奧萊博科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)購自杭州仟諾生物科技有限公司；Annerxin V/FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；MDA、LDH、CAT、SOD檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京麥瑞博生物科技有限公司。

1.2 風(fēng)輪菜總黃酮的制備 風(fēng)輪菜購自本地中草藥店，經(jīng)本院中西醫(yī)結(jié)合科主任路克文醫(yī)師鑒定為風(fēng)輪菜，取其莖葉洗凈，干燥至恒重后粉碎，取20 g加入適量90%乙醇，超聲波提取風(fēng)輪菜總黃酮，得萃取液，過濾后收集濾液，測定濃度后稀釋至所需濃度備用。

1.3 細胞培養(yǎng)與缺氧/復(fù)氧(H/R)模型建立 心肌細胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞先在95%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)6 h，然后復(fù)氧3 h，更換培養(yǎng)基在正常條件下培養(yǎng)，建立H/R模型，對照組(Con)一直在常規(guī)條件下培養(yǎng)。

1.4 細胞處理與分組 分別用濃度為0、1.563、3.125、6.250、9.375、12.500、18.750、25.000、28.125、31.250 μg/ml的風(fēng)輪菜總黃酮處理H9c2細胞12 h，然后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，以檢測風(fēng)輪菜總黃酮對心肌細胞的毒性作用。

分別用濃度為6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml的風(fēng)輪菜總黃酮處理H9c2細胞12 h，然后按照1.3中方法進行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為H/R+藥物-1組、H/R+藥物-2組、H/R+藥物-3組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細胞中進行缺氧/復(fù)氧處理，記為H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-702-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細胞后，用25 μg/ml風(fēng)輪菜總黃酮處理12 h，再進行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為H/R+藥物-3+anti-miR-NC組、H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組。anti-miR-NC序列：CGAGGGTCTGGCAAGGAGGGA；anti-miR-702-5p序列：GAGCGGGGTAAAGGGTGGGCA。

1.5 Western blot檢測P21、Caspase-3蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行定量。取50 μl蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗P21(1∶800)、Caspase-3(1∶800)，4 ℃過夜，加入二抗山羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)室溫培養(yǎng)1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達水平=目的條帶和GAPDH條帶的比值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.6 CCK-8檢測細胞存活率 各組培養(yǎng)48 h的細胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細胞存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后,用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 試劑盒檢測MDA含量及LDH、CAT、SOD活性 細胞培養(yǎng)48 h后,收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進行操作。

1.9 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-702-5p表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-702-5p以U6為內(nèi)參進行PCR擴增，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-702-5p上游引物序列：5′-TCGGCAGGGAGCGGGGTA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 用不同濃度的風(fēng)輪菜總黃酮處理心肌細胞，結(jié)果顯示，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理的心肌細胞的存活率無顯著差異，說明風(fēng)輪菜總黃酮對正常心肌細胞無毒性(表1)。

表1 風(fēng)輪菜總黃酮對心肌細胞存活率的影響

與對照組相比，H/R組miR-702-5p表達水平升高，P21、Caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理組miR-702-5p表達水平降低，P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響

圖1 風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達的影響注：A.風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達

2.2 風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響 與對照組相比，H/R組MDA含量升高，LDH活性升高，CAT、SOD活性降低(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響

2.3 干擾miR-702-5p的轉(zhuǎn)染效率 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-702-5p組miR-702-5p表達水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 miR-702-5p的表達

2.4 干擾miR-702-5p表達聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組P21、Caspase-3表達水平顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2，表5)。

表5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響

圖2 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達的影響注：A.干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達

2.5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響 與H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表6)。

表6 過表達、干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響

3 討論

大量氧自由基的產(chǎn)生是缺血再灌注損傷的重要病理機制之一，而中藥具有抗心肌缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的作用[11-14]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物含量可反映機體損傷程度；過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是機體清除自由基的酶，有抗氧化作用[15]。乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是糖無氧代謝的關(guān)鍵酶，細胞膜受損時，LDH可漏出細胞外，因此，檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的活性可間接反映細胞受損程度[16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度風(fēng)輪菜總黃酮預(yù)處理后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說明風(fēng)輪菜總黃酮可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激及細胞凋亡；風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞具有顯著保護作用。

研究表明，miRNA與應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡有關(guān)，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[17]。敲低心肌細胞miR-497可改善缺氧/復(fù)氧心肌細胞損傷[18]。miR-214可減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中miR-702-5p表達水平顯著升高，提示miR-702-5p可能與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷有關(guān)。本實驗通過轉(zhuǎn)染miR-702-5p的干擾表達載體，研究抑制miR-702-5p表達是否對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷有保護作用，結(jié)果顯示，抑制miR-702-5p表達后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說明抑制miR-702-5p表達可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

本實驗結(jié)果顯示，與單獨轉(zhuǎn)染miR-702-5p干擾表達載體或單獨用風(fēng)輪菜總黃酮處理，細胞凋亡率顯著降低，氧化應(yīng)激水平也顯著降低。表明兩者聯(lián)合作用對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用更顯著。同時本研究結(jié)果還顯示，風(fēng)輪菜總黃酮單獨處理后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中miR-702-5p表達水平顯著降低，提示風(fēng)輪菜總黃酮對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用可能與降低miR-702-5p的表達有關(guān)。

綜上所述，風(fēng)輪菜總黃酮聯(lián)合抑制miR-702-5p表達可保護缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。