張 寧，馬 競，武國利

0 引言

缺血后再灌注是急性心肌梗死、缺血性心肌病等重要治療手段，而缺血再灌注引起的心肌細胞損傷嚴重阻礙了其療效[1-2]。因此，減少或抑制缺血再灌注損傷對臨床治療相關心血管疾病具有重要意義。研究表明，中藥治療心肌缺血再灌注損傷療效顯著，可通過抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過氧化作用、減少炎性細胞浸潤、抑制心肌細胞凋亡等保護心肌細胞損傷[3-5]。風輪菜是唇形科風輪菜屬植物，黃酮是其主要活性成分，風輪菜活性部位具有抗氧化、保護內(nèi)皮細胞的作用[6-7]。研究顯示，miRNA在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，可作為診斷心血管疾病的敏感生物標志物[8]。如抑制miR-30c-2-3p可減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷[9]。在自噬性心肌保護中，Notch1信號通路中miR-702-5p差異表達，其可能在自噬性心肌保護中發(fā)揮重要作用[10]。本實驗通過建立缺氧/復氧心肌細胞模型，研究風輪菜總黃酮聯(lián)合miR-702-5p對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細胞H9c2購自美國ATCC細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；P21(貨號：bs-10129R-1)、Caspase-3抗體(貨號：bs-0081R-1)購自上海恒斐生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP(貨號：F030212-EBU)購自北京百奧萊博科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)購自杭州仟諾生物科技有限公司；Annerxin V/FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；MDA、LDH、CAT、SOD檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京麥瑞博生物科技有限公司。

1.2 風輪菜總黃酮的制備 風輪菜購自本地中草藥店，經(jīng)本院中西醫(yī)結(jié)合科主任路克文醫(yī)師鑒定為風輪菜，取其莖葉洗凈，干燥至恒重后粉碎，取20 g加入適量90%乙醇，超聲波提取風輪菜總黃酮，得萃取液，過濾后收集濾液，測定濃度后稀釋至所需濃度備用。

1.3 細胞培養(yǎng)與缺氧/復氧(H/R)模型建立 心肌細胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞先在95%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)6 h，然后復氧3 h，更換培養(yǎng)基在正常條件下培養(yǎng)，建立H/R模型，對照組(Con)一直在常規(guī)條件下培養(yǎng)。

1.4 細胞處理與分組 分別用濃度為0、1.563、3.125、6.250、9.375、12.500、18.750、25.000、28.125、31.250 μg/ml的風輪菜總黃酮處理H9c2細胞12 h，然后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，以檢測風輪菜總黃酮對心肌細胞的毒性作用。

分別用濃度為6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml的風輪菜總黃酮處理H9c2細胞12 h，然后按照1.3中方法進行缺氧/復氧處理，分別記為H/R+藥物-1組、H/R+藥物-2組、H/R+藥物-3組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細胞中進行缺氧/復氧處理，記為H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-702-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細胞后，用25 μg/ml風輪菜總黃酮處理12 h，再進行缺氧/復氧處理，分別記為H/R+藥物-3+anti-miR-NC組、H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組。anti-miR-NC序列：CGAGGGTCTGGCAAGGAGGGA；anti-miR-702-5p序列：GAGCGGGGTAAAGGGTGGGCA。

1.5 Western blot檢測P21、Caspase-3蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行定量。取50 μl蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗P21(1∶800)、Caspase-3(1∶800)，4 ℃過夜，加入二抗山羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)室溫培養(yǎng)1 h，加入化學發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達水平=目的條帶和GAPDH條帶的比值。每個蛋白樣品設3個重復，實驗重復3次。

1.6 CCK-8檢測細胞存活率 各組培養(yǎng)48 h的細胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細胞存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后,用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.8 試劑盒檢測MDA含量及LDH、CAT、SOD活性 細胞培養(yǎng)48 h后,收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進行操作。

1.9 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-702-5p表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-702-5p以U6為內(nèi)參進行PCR擴增，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-702-5p上游引物序列：5′-TCGGCAGGGAGCGGGGTA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響 用不同濃度的風輪菜總黃酮處理心肌細胞，結(jié)果顯示，各濃度風輪菜總黃酮處理的心肌細胞的存活率無顯著差異，說明風輪菜總黃酮對正常心肌細胞無毒性(表1)。

表1 風輪菜總黃酮對心肌細胞存活率的影響

與對照組相比，H/R組miR-702-5p表達水平升高，P21、Caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風輪菜總黃酮處理組miR-702-5p表達水平降低，P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響

圖1 風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達的影響注：A.風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達

2.2 風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響 與對照組相比，H/R組MDA含量升高，LDH活性升高，CAT、SOD活性降低(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風輪菜總黃酮處理組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響

2.3 干擾miR-702-5p的轉(zhuǎn)染效率 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-702-5p組miR-702-5p表達水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 miR-702-5p的表達

2.4 干擾miR-702-5p表達聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響 H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組P21、Caspase-3表達水平顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2，表5)。

表5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響

圖2 干擾miR-702-5p聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達的影響注：A.干擾miR-702-5p聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達

2.5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響 與H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表6)。

表6 過表達、干擾miR-702-5p聯(lián)合風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達的影響

3 討論

大量氧自由基的產(chǎn)生是缺血再灌注損傷的重要病理機制之一，而中藥具有抗心肌缺血再灌注后氧化應激損傷的作用[11-14]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物含量可反映機體損傷程度；過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是機體清除自由基的酶，有抗氧化作用[15]。乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是糖無氧代謝的關鍵酶，細胞膜受損時，LDH可漏出細胞外，因此，檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的活性可間接反映細胞受損程度[16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度風輪菜總黃酮預處理后，缺氧/復氧誘導的心肌細胞中P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說明風輪菜總黃酮可抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激及細胞凋亡；風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞具有顯著保護作用。

研究表明，miRNA與應激反應、細胞凋亡有關，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[17]。敲低心肌細胞miR-497可改善缺氧/復氧心肌細胞損傷[18]。miR-214可減輕心肌缺血再灌注導致的心肌損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復氧誘導的心肌細胞中miR-702-5p表達水平顯著升高，提示miR-702-5p可能與缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷有關。本實驗通過轉(zhuǎn)染miR-702-5p的干擾表達載體，研究抑制miR-702-5p表達是否對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷有保護作用，結(jié)果顯示，抑制miR-702-5p表達后，缺氧/復氧誘導的心肌細胞中P21、Caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說明抑制miR-702-5p表達可抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷。

本實驗結(jié)果顯示，與單獨轉(zhuǎn)染miR-702-5p干擾表達載體或單獨用風輪菜總黃酮處理，細胞凋亡率顯著降低，氧化應激水平也顯著降低。表明兩者聯(lián)合作用對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用更顯著。同時本研究結(jié)果還顯示，風輪菜總黃酮單獨處理后，缺氧/復氧誘導的心肌細胞中miR-702-5p表達水平顯著降低，提示風輪菜總黃酮對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用可能與降低miR-702-5p的表達有關。

綜上所述，風輪菜總黃酮聯(lián)合抑制miR-702-5p表達可保護缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷。