沈 達(dá)，王 健，宋海港，邱 添，徐 強(qiáng)，成大榮*

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2．江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)正常菌群成員之一，在人或動物出生的數(shù)小時后經(jīng)過口進(jìn)入消化道后段，繁殖定居且終生伴隨[1]。致病性大腸桿菌僅是大腸桿菌中的一小部分，但大量繁殖會給人類帶來生命威脅和財產(chǎn)損失，尤其對嬰兒和幼畜（禽），常引發(fā)嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[2]，引起大面積的發(fā)病和死亡。目前主要應(yīng)用抗生素治療該病，從而導(dǎo)致臨床上的耐藥菌株越來越多，并且會不斷產(chǎn)生許多新的耐藥菌株，進(jìn)而應(yīng)用抗生素治療的效果較差[3]。本試驗以水禽源大腸桿菌為研究對象，研究其在江蘇地區(qū)的流行情況及對分離株的藥物敏感情況，為高效快速防治水禽源大腸桿菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2017～2019年共采集江蘇省10個地級市64個水禽養(yǎng)殖場的疑似大腸桿菌性腹瀉510份泄殖腔拭子，樣品來源信息見表1。

表1 樣品來源Tab.1 Sample source

1.1.2 試驗試劑

瓊脂糖購自索萊寶生物有限公司；10×TBE緩沖液購自生工生物工程股份有限公司；DL2000 DAN Marker購自Mix購維諾贊生物公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物公司。

1.1.3 PCR引物

根據(jù)陳曉浪等[4]的研究報道，基于對不同毒力基因序列的分析設(shè)計引物。PCR引物序列見表2。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。

1.2 試驗方法

1.2.1 參考菌株及待檢樣品基因組的提取

以 F1+大 腸 桿 菌（C1253-77株）、P+大 腸 桿 菌(C1976-79株)、LEE+大腸桿菌（S442712株）、沙門氏菌（ATCC25923株）、HPI+大腸桿菌（S452631株）為參考菌株建立水禽源致病性大腸桿菌PCR檢測方法。以上菌株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物教研組保存。

表2 PCR的引物序列Tab.2 PCR primer sequences

運(yùn)用煮沸法提取細(xì)菌的DNA模板：吸取液體培養(yǎng)物600 μL于離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；棄去上清，重新懸浮于800 μL的去離子水中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；再次棄去上清，重新懸浮于300 μL的去離子水中；100 ℃水浴10 min；冰浴1 min；13 000 r/min離心5 min；吸取上清即為制備好的DNA模板，存于4 ℃冰箱備用[5]。

1.2.2 大腸桿菌菌毛基因的檢測

用PCR方法對F1菌毛基因進(jìn)行擴(kuò)增。取待檢測DNA為模板，擴(kuò)增的F1引物為F1-F、F1-R，各引物濃度50 μmol/L。PCR的體系：細(xì)菌DNA1 μL、上下游引物0.5 μL、Mix12.5 μL，加入去離子水至整個體系25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

用PCR方法對P菌毛基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增P菌毛基因引物為Pap-F、Pap-R，引物濃度50 μmol/L，PCR體系同上。PCR反應(yīng)程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、60 s，每2個循環(huán)降低1 ℃，共8個循環(huán)；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s 共 30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.2.3 LEE毒力島的檢測

用PCR方法對LEE毒力島eaeA基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性引物為eae-F、eae-R。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物0.5 μL，Mix12.5 μL，取待檢測DNA模板1 μL，再加入去離子水至整個體系25 μL。按以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s；58 ℃、30 s；72 ℃、60 s，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存[6]。

1.2.4 HPI毒力島的檢測

用PCR方法對HPI毒力島irp2基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性引物為irp2-F，irp2-R，PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.3。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

取各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2 000 Marker為參照，觀察擴(kuò)增基因片段的大小。

1.3 PCR陽性菌純化與純化菌的鑒定

對PCR陽性菌進(jìn)行麥康凱平板三區(qū)劃線，挑取單菌落進(jìn)行細(xì)菌純化培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)12 h，進(jìn)行3次純化，得到純化菌再次進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 藥敏試驗

將挑取的陽性菌涂布于MH培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。吸取200 μL菌液涂布于平板上，藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基上，使其附著嚴(yán)密。37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑，判斷該菌對測試紙片的敏感度[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性大腸桿菌分離鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1～圖4。由圖1～圖4可知，對純化菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增F1菌毛基因、P菌毛基因、LEE（eaeA）基因與HPI（irp2）基因，均可擴(kuò)增出目的片段。

2.2 樣品的快速檢測結(jié)果

純化菌PCR鑒定后，樣品的快速檢測結(jié)果見表3。由表3可知，江蘇省各地區(qū)致病性大腸桿菌陽性率均在65%左右。

表3 樣品的快速檢測結(jié)果Tab.3 Quick test results of samples

2.3 樣品的快速藥敏試驗結(jié)果（見表4）

各地區(qū)分離株均挑取10株用13種抗生素進(jìn)行藥敏試驗。由表4可知，致病性大腸桿菌對磷霉素、多黏菌素B比較敏感，敏感比例分別為90%和78%，耐藥最強(qiáng)的是多西環(huán)素，耐藥比例可達(dá)90%，其次是新霉素和四環(huán)素，耐藥比例均為70%。

表4 樣品的快速藥敏試驗結(jié)果Tab.4 Results of rapid drug sensitivity test of samples

3 討論

水禽養(yǎng)殖過程中，由大腸桿菌引起的繼發(fā)性疾病較多且難控制?？刂拼竽c桿菌在養(yǎng)殖場及水禽體內(nèi)的繁殖可以解決根本性問題。在飼養(yǎng)過程中應(yīng)嚴(yán)格把控各個環(huán)節(jié)，通過科學(xué)用藥最大限度抑制大腸桿菌的繁殖[8]。通過不同株大腸桿菌的藥敏試驗，確定江蘇不同地區(qū)養(yǎng)殖場中常駐大腸桿菌的類型及耐藥情況，可以選擇科學(xué)的給藥方案，進(jìn)而有效控制和治療大腸桿菌病。

當(dāng)前，敏感藥物的療效雖然較好，但其價格較高，只有環(huán)丙沙星價格相對便宜，長期、超量使用勢必引起細(xì)菌的耐藥性。臨床上治療細(xì)菌性傳染病時，需要科學(xué)用藥、謹(jǐn)慎用藥。在用藥前先做藥敏試驗，根據(jù)結(jié)果針對性用藥。同時，不應(yīng)長期使用一種藥物治療，應(yīng)考慮藥物組合、藥物輪換，尋找抗菌藥物替代品及采用綜合防控措施，力爭少用藥、不用藥。

傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式已不適應(yīng)新形勢下對疾病防控及動物源農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量提升的要求。當(dāng)養(yǎng)殖場發(fā)生細(xì)菌性疾病時，盲目濫用抗生素只會導(dǎo)致病原菌大量出現(xiàn)耐藥性，增加疾病防控的難度。未來，尋找抗生素替代品，實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，保障食品安全將是養(yǎng)殖業(yè)追求的共同目標(biāo)。

本研究通過對江蘇省內(nèi)各地區(qū)的水禽進(jìn)行致病性大腸桿菌毒力因子的檢測，了解水禽源大腸桿菌的流行情況，完善江蘇地區(qū)流行病學(xué)數(shù)據(jù)。從江蘇水禽中分離大腸桿菌進(jìn)行13種抗生素藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)江蘇各地區(qū)所分離到的水禽源致病性大腸桿菌中有著不同程度的藥物敏感性，但總體對磷霉素、多黏菌素B比較敏感。本研究為該地區(qū)的大腸桿菌耐藥情況制定合理的防治方案提供參考。藥敏試驗快速篩選敏感藥物及快速有效治療，可以減少抗生素的濫用與耐藥性的產(chǎn)生，節(jié)約養(yǎng)殖成本。

4 結(jié)論

研究通過PCR技術(shù)快速確診了江蘇部分地區(qū)養(yǎng)殖場中的疑似大腸桿菌病例，對已分離的大腸桿菌進(jìn)行多種抗生素藥敏試驗，實現(xiàn)對敏感藥物的快速篩選。