楊勇飛，張 成，張雪萍，童劍軍，高 娜,李有文*

（1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3．塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

山羊痘是由山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。本病以發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹及淋巴結病變?yōu)橹饕卣?，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病[1-3]。山羊痘病毒為DNA病毒，約150 kb，呈線形，A、T含量為75%。中部是核心編碼區(qū)域，編碼與病毒生長繁殖等重要蛋白有關的基因；兩端為側翼序列，編碼與病毒毒力因子和宿主范圍蛋白有關的基因在基因組側翼序列中有5個ANK錨定蛋白樣基因?；蚪M的最末端是兩條鏈交叉連接的發(fā)卡環(huán)，緊接著由兩套獨特序列隔開的串聯(lián)排列的多拷貝的重復序列（綿羊痘病毒為46 bp、塊狀皮膚病病毒5 bp、山羊痘病毒中未發(fā)現(xiàn)），然后是編碼多肽的序列。羊痘病毒對宿主的選擇非常嚴格，綿羊痘只感染綿羊，山羊痘只感染山羊，很少發(fā)生交叉感染[4]。近年來羊痘病毒出現(xiàn)交叉感染，甚至出現(xiàn)感染人的報道，說明病毒的宿主范圍發(fā)生了改變[5-6]。病原的宿主嗜性發(fā)生改變有2種可能：一是病原的毒力增強；二是病原的宿主范圍基因改變。ANK基因可能與病毒感染宿主范圍有關。為了解羊痘跨物種感染與錨定蛋白的關系，從試驗角度研究錨蛋白是否具有宿主范圍因子的功能及其機理，用融合PCR方法和Overlap PCR方法構建不同羊痘病毒ANK基因缺失的轉移載體，并且通過基因同源重組得到ANK基因缺失重組羊痘病毒以確認ANK基因對病毒宿主范圍選擇的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

毒株與菌株：山羊痘病毒（來自新疆南疆2010年流行的羊痘分離株）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pEGFP質粒，均由塔里木畜牧科技重點實驗室保存。

試劑：限制性內切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ、dNTP、DL-2 000 Marker、T4 DNA連接酶、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自Hyclone公司；胎牛血清購自GIBCO公司；二甲基亞砜購自VETEC公司；1∶250胰蛋白酶、氨芐霉素、青霉素、鏈霉素均購自Blosharp生物科技有限公司；pEASY-T1載體、DNA/RNA病毒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成

根據(jù)已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的羊痘病毒基因全序列（登錄號為NC_004003.1），用DNAMAN軟件設計5對錨蛋白 ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145基因的特異性引物，見表1。引物送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行合成。

1.2.2 山羊痘病毒SS株基因組提取

將細胞培養(yǎng)物從-80 ℃冰箱取出并平衡至室溫，吸取200 μL，加入1.5 μL離心管中，根據(jù)DNA提取試劑盒操作說明進行山羊痘病毒SS毒株基因組提取，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 山羊痘病毒SS株5個ANK基因缺失的表達載體構建

1.2.3.1 ANK010和ANK138基因采用融合PCR方法擴增

分段進行PCR擴增：以SS株的基因組為模板，分別擴增ANK010、ANK138兩端側翼（P1P2、P5P6）以pE-GFP質粒為模板擴增GFP基因（P3P4）。擴增體系25 μL ：buffer 5 μL、dNTP 1 μL、模板 1.5 μL、上下游引物各 0.6 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16 μL。擴增程序 ：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

預融合：以分段PCR產物作為模板，不需要引物進行擴增，擴增體系25 μL：前后兩臂PCR產物加入1.2 μL、中間GFP的PCR產物加入0.4 μL、buffer 5 μL、dNTP 1 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16.6 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，ll個循環(huán)；72 ℃ 10 min ；4 ℃保存。

正式融合：以預融合產物為模板進行擴增，每個組合只加P1和P6引物即可。擴增體系25 μL：上下游引物各 0.6 μL、Buffer 5 μL、dNTP 5 μL、模板 1.9 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16.6 μL。擴增程序 ：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min ；4 ℃保存。

1.2.3.2 ANK140、ANK141.2和ANK145基因采用Overlap PCR方法擴增

擴增體系25 μL：模板pE-GFP質 0.9 μL、上下游引物各 0.6 μL、Easy Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。擴增程序 ：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共28個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

表1 山羊痘病毒SS株5個ANK基因擴增所用的引物序列Tab.1 Primers used for amplification of 5 ANK genes in SS strain of goat pox virus

1.2.3.3 連接轉化

配置1%普通瓊脂糖凝膠，點樣后進行電泳。PCR產物用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收。連接分別做5 μL體系（目的片段4 μL、T載體0.5 μL、ddH2O 0.5 μL），將質粒轉到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行涂板至Kana固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h。

1.2.3.4 菌液PCR和雙酶切

菌液PCR擴增體系10 μL：菌液0.8 μL、每個組合加兩端引物各0.3 μL、Easy Taq Mix 5 μL、ddH2O 3.2 μL。取2～4個陽性菌的菌液40～100 μL加入至含Kana的液體LB培養(yǎng)基6 mL，搖菌12～14 h，直至液體渾濁。按照質粒小提試劑盒說明書提取質粒，并進行電泳鑒定。

雙酶切（Hind Ⅲ/XhoⅠ），酶切條件為16 ℃，酶切 3～4 h，Buf Tango 1 μL、Hind Ⅲ 0.5 μL、Xho Ⅰ 0.5 μL、質粒 5 μL、ddH2O 3 μL。

1.3 病毒重組及鑒定

將經(jīng)鑒定的陽性質粒用Lip 2000轉染至已經(jīng)感染SS株羊痘病毒的綿羊睪丸細胞（轉染過程按說明書操作），繼續(xù)培養(yǎng)促使其與病毒同源重組，并且在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光產生從而判斷病毒同源重組情況。

2 結果與分析

2.1 山羊痘病毒SS株5個ANK基因缺失的克隆鑒定

以ANK010、ANK138分段產物為模板進行PCR擴增，PCR產物經(jīng)電泳檢測，結果見圖1。其余3個ANK基因以pE-GFP質粒為模板進行PCR擴增，PCR產物經(jīng)電泳檢測，結果見圖2。

由圖1可知，ANK010、ANK138基因片段大小皆為為1 200 bp，與理論大小相符。

由圖2可知，該3個ANK基因片段大小皆為900 bp，與理論大小相符。

2.2 菌液PCR鑒定

分別將5個缺失ANK基因構建的表達載體經(jīng)轉化，將其搖至渾濁的菌液，進行菌液PCR鑒定，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。ANK010、ANK138出現(xiàn)的陽性條帶基因片段大小為1 200 bp，ANK140、ANK141.2和ANK145出現(xiàn)的陽性條帶基因片段大小皆為900 bp，與理論大小相符。

2.3 雙酶切鑒定

對構建的5個ANK基因缺失表達載體經(jīng)轉化搖菌提取的質粒進行雙酶切鑒定（HindⅢ/XhoⅠ），其產物經(jīng)電泳檢測，結果見圖3。

由圖3可知，ANK010、ANK138重組質粒被切開的基因片段大小分別為3 900 bp與1 200 bp分別符合T載體與ANK010、ANK138基因片段大小，與理論大小相符；ANK140、ANK141.2和ANK145重組質粒被切開的基因片段大小皆分別為3 900 bp與900 bp，分別符合T載體與ANK140、ANK141.2和ANK145基因片段大小，與理論大小相符。

2.4 病毒重組及鑒定

將已鑒定正確的重組質粒進行接毒轉染，在轉染之后的24、48和72 h分別在明場和熒光場觀察，結果見圖4。

由圖4可知，ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145重組質粒轉染細胞后，在顯微鏡下均出現(xiàn)綠色熒光。

3 討論

羊痘是動物痘病毒中較為嚴重的一種疫病，不僅感染率高，而且死亡率極高，羔羊死亡率高達100%，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重損失[7]。近年來羊痘病毒出現(xiàn)交叉感染，甚至出現(xiàn)感染人的報道，使羊痘病毒的傳播風險陡增，危害也成倍加大，因此研究其跨物種傳播的機理和原因至關重要[12-13]。很多研究顯示，ANK基因是正痘病毒的宿主范圍基因，參與痘病毒對其感染宿主的選擇，因此理論上ANK基因也可能是羊痘病毒宿主范圍基因，但缺乏實驗室的相關證明[8-9]。ANK基因作為細胞中重要的結聯(lián)蛋白或互作蛋白，具有廣泛的生物學功能。為研究其生物學功能，了解其是否與羊痘病毒宿主范圍選擇有關，本研究構建SS新疆分離株的5個ANK基因缺失的山羊痘病毒，為其功能研究奠定基礎。

本試驗根據(jù)已在GenBank上發(fā)表的山羊痘病毒株（登錄號為NC_004003.1）的5個ANK基因ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145基因序列，采用2種方法設計并構建其基因缺失的山羊痘重組病毒。首先選擇綠色熒光蛋白（GFP）為報告基因，以ANK基因本身的啟動子為啟動子構成報告系統(tǒng)，這樣一方面簡化構建過程，不需要擴增克隆啟動子，只要將GFP基因直接替換ANK基因就可以實現(xiàn)報告系統(tǒng)的表達；另一方面，GFP作為報告基因，其表達的熒光容易觀察，只要在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光就可以證明病毒發(fā)生了重組。其次選擇ANK基因兩側的一段核苷酸序列為同源臂，分別加在GFP基因的上5'端和3'端，便于發(fā)生同源重組[10-11]。同時，為了確定同源重組效果與同源臂長短的關系，設計300 bp和60 bp大小的兩種同源臂，前者用融合PCR方法與GFP基因連接到一起（ANK010、ANK138），融合基因片段總長度為1 200 bp，后者用Overlap PCR的方法將同源臂加在GFP兩側（ANK140、ANK141.2和ANK145），連接后基因片段總長度為850～900 bp。各種設計均可以克隆為基因缺失表達載體，構建好的表達載體轉染SS毒株感染的羔羊睪丸細胞，最終5個ANK基因缺失的表達載體均得到了重組病毒，說明同源臂為60 bp也可能發(fā)生同源重組，但從同源效率上看，300 bp同源臂的表達載體明顯高于60 bp，這與同源重組原理理論相一致。

通過本次試驗，發(fā)現(xiàn)羊痘病毒同源重組是較易實現(xiàn)的，其重組效率與同源臂的長短呈正相關關系，所以構建重組羊痘病毒時，在條件允許的情況下，設計較長的同源臂較為合理。另外，因為羊痘病毒基因組成中，AT含量達到75%以上，所以引物設計時應該注意引物序列的選擇，盡量選取GC含量相對較高的序列，并且對引物要進行全面評價，評分太低會給后續(xù)研究帶來不能擴增或出現(xiàn)大量的特異擴增的問題。本試驗中的引物是改進2～3次才得以擴增。

4 結論

本試驗采用融合PCR和Overlap PCR方法獲得山羊痘病毒SS毒株5個ANK基因缺失的表達載體片段，并成功獲得表達載體；60 bp以上的同源臂可以得到重組病毒，同源臂越長其重組效率越高。