霍金海，劉亞娟，任曉蕾，孫國東，劉政，孫建峰，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥研究所，哈爾濱 150036）

防風為傘形科植物防風[Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.]未抽花莖植株的干燥根，是中國常用的大宗藥材之一。李時珍《本草綱目》記載：“防者防御也，因其功療風最要，故名防風?！狈里L被歷版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）收載，具有祛風除濕解表、止痙止痛之功效[1]。主產(chǎn)于黑龍江省以及內(nèi)蒙古自治區(qū)的關(guān)防風，屬于防風中的上品。其中以黑龍江省杜爾伯特草原地區(qū)出產(chǎn)的小蒿子防風質(zhì)量最優(yōu)，馳名中外[2]。近年來，關(guān)防風的過度開發(fā)造成了野生數(shù)量豐度的銳減，以致關(guān)防風價格是栽培防風的5～6倍?！吨袊幍洹芬陨檐盏谋雍秃繙y定以及5-O-甲基維斯阿米醇苷含量測定為評價指標，無法準確衡量藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，難以實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價。

近年來，劉昌孝院士等[3]基于現(xiàn)有質(zhì)量評價與控制方法及存在問題，提出中藥質(zhì)量標志物（Q-marker）的概念。Q-marker是指中藥材和中藥產(chǎn)品（如中藥飲片、提取物及中成藥制劑等）中能夠體現(xiàn)藥理活性的化學物質(zhì)，為其固有化學成分或加工制備過程中形成的物質(zhì)，可以作為反映中藥安全性和有效性的標志性物質(zhì)進行質(zhì)量控制，也可作為定性定量分析的指標性成分[4-8]。

中藥材道地性評價的核心是確定Q-marker，筆者認為中藥材復雜成分的快速分析和表征是確定Q-marker的前提。近年來，通過對高靈敏度的質(zhì)譜（MS）和高效分離能力超高效液相色譜（UPLC）結(jié)合，加速了Q-marker的發(fā)現(xiàn)與鑒定。課題組前期采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCQ-TOF-MS/MS）分析了防風95種化學成分，并找出了47個入血成分，對色原酮類裂解規(guī)律進行了重點研究[9]，并檢索了其生物活性。良好的體內(nèi)吸收和生物活性是中藥小分子有效成分發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，然而在不同產(chǎn)地的含量差異性才是決定一個化合物能否成為質(zhì)量差異標志物的關(guān)鍵。因此，本研究通過對不同產(chǎn)地防風藥材應用主成分分析（PCA分析），找出差異性化學成分，初步明確防風的質(zhì)量差異標志物，以期為防風質(zhì)量鑒別及評價標準的建立提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UPLC色譜儀、5600+型高分辨質(zhì)譜儀（AB SCIEX，美國），數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF 1.6 software，數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Markerview1.2.1、Peakview 2.0、masterview1.0（AB SCIEX，美國），Waters UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column預柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）（Waters，美國），KQ-300DB 型超聲提取儀（昆山超聲儀器），BSA224S-CW型精密天平（德國賽多利斯），LG16-W型離心機（北京京立）。

1.2 試劑 甲酸（Fisher，美國）、甲醇（科密歐，中國天津）、乙腈（Merck，德國），均為色譜純，蒸餾水（屈臣氏，中國廣州）。

1.3 藥材與對照品 防風藥材于2016年10月取自黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)道地產(chǎn)區(qū)以及全國其他產(chǎn)地，每產(chǎn)地取3份樣品，每份樣本10株，詳見表1。防風藥材均經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，置于通風處陰干，粉碎（過3號篩）備用。

表1 不同產(chǎn)地防風樣品信息表

5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：J-002-150420，成都瑞芬思生物科技有限公司）、補骨脂素（批號：110739-200511，中國藥品生物制品檢驗檢定所），純度均在98%以上。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品各約1.25 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容制成對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱定不同產(chǎn)地防風藥材粉末1.0 g于50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇并稱質(zhì)量，水浴回流1 h，放冷、補重后搖勻，取續(xù)濾液13 000 r/min離心5 min，離心半徑為5 cm，取上清液，即得。

2.3 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），預柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），柱溫30℃，流動相A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫（0～10 min，95%～50%A；10～13 min，50%～30%A；13～15 min，30%A；15～20 min，30%～0%A；20～20.1 min，0%～95%A；20.1～25 min，95%～A），流速 0.3 mL/min，進樣量 3 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）正離子模式，離子源溫為550℃，碰撞電壓500 V，裂解電壓（DP）為80 V，碰撞能量（CE）、碰撞能量擴展（CES）分別為35 eV、15 eV。氮氣為霧化氣體，輔助氣Gas1、Gas2均為55 PSI，氣簾氣Cur Gas為35 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為80～1 500 Da，相關(guān)信息掃描（IDA）設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 500 Da，設置動態(tài)背景扣除（DBS）扣除背景。

2.5 數(shù)據(jù)分析 1）供試品溶液進樣，采集液質(zhì)圖。2）通過質(zhì)譜處理工作站（Markerview）進行PCA分析得到得分矩陣圖（Scores）和載荷矩陣圖（Loadings）。通過對Scores的獲取得到產(chǎn)地差異數(shù)據(jù)的分型信息，而Loadings可以顯示該離子在各產(chǎn)地樣品內(nèi)的提取離子（XIC）峰面積變化。3）通過鑒定差異的化合物，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)與同位素峰度比對分子式進行確定，結(jié)合現(xiàn)有的文獻報道，通過對照品與數(shù)據(jù)庫的二級譜圖比對以及裂解規(guī)律的分析，最終確定結(jié)構(gòu)式。4）結(jié)合前期防風體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)研究及活性文獻報道，確定候選質(zhì)量差異標志物。5）分析候選質(zhì)量差異標志物在防風道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)的含量變化規(guī)律，初步確定質(zhì)量差異標志物。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析 正離子模式下，按照“2.3”及“2.4”項條件進行分析，得到了良好的分離效果圖及較強的離子強度峰，得到其總離子流圖（TIC圖）見圖1。

圖1 防風供試品正離子TIC圖

3.2 質(zhì)量差異標志物篩選與結(jié)構(gòu)鑒定 PCA結(jié)果見圖2。由圖2A可知，黑龍江省產(chǎn)地的樣品聚類良好，內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)地的樣本較為分散，可能與其地理位置跨度較大有關(guān)，兩者有一定的交集，該結(jié)果與關(guān)防風道地藥材主產(chǎn)于黑龍江省東北部及內(nèi)蒙古自治區(qū)，以黑龍江杜爾伯特西部草原及呼盟草原為核心產(chǎn)區(qū)的分布相符合。與非道地產(chǎn)區(qū)河北省、安徽省樣本存在較大差異，與山西省產(chǎn)地樣品有一定的差異，說明藥材的道地性與其次生代謝產(chǎn)物之間存在一定聯(lián)系。

圖2 不同產(chǎn)地防風藥材PCA圖

通過PCA模式識別分析，選擇道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)有顯著性差異（P＜0.05）且離子強度差異倍數(shù)Fold Change＞1.5倍的離子，結(jié)合前期防風體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)以及生物活性文獻報道兩個方面的信息初步確定防風10個候選質(zhì)量差異標志物，分別為5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、Ledebouriellol、亥茅酚、3-O-乙酰亥茅酚、3-O-當歸乙酰亥茅酚、花椒毒素、補骨脂素、紫花前胡苷元，結(jié)果見表2，典型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律總結(jié)如下。

表2 防風候選質(zhì)量差異標志物結(jié)構(gòu)信息表

3.2.1 色原酮類 呋喃色原酮是以二氫呋喃環(huán)連接的色原酮母核構(gòu)成，以下為呋喃色原酮類化合物5-O-甲基維斯阿米醇苷的裂解分析。保留時間（tR）為5.91 min，準分子離子峰在正離子模式下為m/z=453[M+H]+，能夠脫去1分子葡萄糖產(chǎn)生m/z=291[M+H-C6H10O5]+碎片離子，此碎片為色原酮母核結(jié)構(gòu)，極為穩(wěn)定，但在高能碰撞下進一步脫去1分子氧化氫（H2O）產(chǎn)生碎片離子m/z=273[M+H-C6H10O5-H2O]+，此碎片離子脫去六元環(huán)上的羰基產(chǎn)生m/z=245[M+H-C6H10O5-H2O-CO]+碎片離子，m/z=291[M+HC6H10O5]+碎片離子也可以失去五元環(huán)上的丙酮醇基團，產(chǎn)生 m/z=231[M+H-C6H10O5-C3H8O]+碎片離子，在繼續(xù)失去六元環(huán)上的羰基產(chǎn)生m/z=203[M+H-C6H10O5-C3H8O-CO]+碎片離子，通過對元素組成分析以及相關(guān)文獻報道[10]，推測分子式為C22H28O10，其相對分子質(zhì)量理論值為453.175 17，實測值為453.175 5，通過與其對照品的二級譜圖比對，結(jié)果見圖3，可以證實這一化合物，推斷其裂解途徑見圖4。

圖3 5-O-甲基維斯阿米醇苷的MS/MS圖

圖4 5-O-甲基維斯阿米醇苷的裂解推斷

3.2.2 香豆素類 苯環(huán)上的7位羥基與6位或者8位形成呋喃環(huán)的香豆素稱之為呋喃香豆素類，以下為呋喃香豆素類化合物補骨脂素裂解分析。tR為8.5 min，正離子模式下的準分子離子峰為m/z=187[M+H]+，脫去呋喃環(huán)上的1分子一氧化碳（CO）產(chǎn)生m/z=159[M+H-CO]+碎片離子，此碎片離子連續(xù)失去兩分子CO產(chǎn)生m/z=131[M+H-2CO]+及m/z=103[M+H-3CO]+兩個碎片，同時準分子離子也可脫去六元環(huán)上的1分子二氧化碳（CO2）產(chǎn)生碎片離子m/z=143[M+H-CO2]+，繼續(xù)脫去呋喃環(huán)上的1分子CO產(chǎn)生m/z=115[M+H-CO2-CO]+碎片離子。通過對元素的組成分析并查閱相關(guān)文獻報道[11]，推測其分子式為C11H6O3，其相對分子質(zhì)量理論值為187.038 05，實測值為187.038 9，通過與補骨脂素的二級譜圖進行比對，結(jié)果見圖5，推測化合物為補骨脂素，裂解途徑見圖6。

圖5 補骨脂素的MS/MS圖

圖6 補骨脂素的裂解推斷

3.3 質(zhì)量差異標志物分析 以10個候選質(zhì)量差異標志物在不同產(chǎn)地的相對含量（峰面積）結(jié)果見圖7，其中 1-11、24、25 號產(chǎn)地內(nèi)蒙古自治區(qū)，12-19 號產(chǎn)地黑龍江省，20號產(chǎn)地山西省，21-23號產(chǎn)地河北省，26號產(chǎn)地安徽省。

3.3.1 5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇 2015版《中國藥典》以5-O-甲基維斯阿米醇苷與升麻素是作為鑒別防風的指標性成分，是其主要的色原酮類化合物[12]。研究表明5-O-甲基維斯阿米醇苷并無明顯的藥理作用[13]，但其水解產(chǎn)物苷元5-O-甲基維斯阿米醇和升麻素具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎活性[14]。從圖7A、7B 可見，5-O-甲基維斯阿米醇苷及其水解產(chǎn)物5-O-甲基維斯阿米醇、升麻素相對含量較高，在26個產(chǎn)地樣本中相對含量（峰面積）差異較大，在PCA分析中所占權(quán)重較大，使其成為差異標志物，但黑龍江省及內(nèi)蒙古自治區(qū)所產(chǎn)關(guān)防風含量自身跨度較大，不能很好與其他產(chǎn)地防風相區(qū)分，難以成為質(zhì)量差異標志物，這正是《中國藥典》僅測定兩個指標的局限性。

圖7 不同產(chǎn)區(qū)防風候選質(zhì)量差異標志物峰面積變化趨勢圖

3.3.2 亥茅酚、3’-O-乙酰亥茅酚、3’-O-當歸乙酰亥茅酚 亥茅酚是色原酮類化合物的重要組分之一，是亥茅酚苷在體內(nèi)水解后的主要化合物，促進亥茅酚苷在體內(nèi)的吸收從而發(fā)揮藥效[14]，由圖7C可見，亥茅酚在內(nèi)蒙古自治區(qū)及黑龍江省所產(chǎn)的關(guān)防風中含量明顯高于安徽省、河北省、山西省等產(chǎn)地，可作為質(zhì)量差異標志物來鑒別防風。而3’-O-乙酰亥茅酚、3’-O-當歸乙酰亥茅酚在道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)含量差異無明顯規(guī)律性，不能作為質(zhì)量差異標志物。

3.3.3 Ledeouriellol Ledeouriellol是防風的色原酮類化合物之一，它既是防風的原型成分，又可以經(jīng)過體內(nèi)酶的作用吸收入血，成為起到治療作用的活性物質(zhì)[14]。由圖7D可見，在內(nèi)蒙古自治區(qū)及黑龍江省所產(chǎn)關(guān)防風中含量顯著高于安徽省、河北省、山西省產(chǎn)地，所以Ledeouriellol也是表征關(guān)防風質(zhì)量的標志物之一。

3.3.4 補骨脂素、花椒毒素、紫花前胡苷元 香豆素是防風中重要的化合物，藥理活性十分廣泛[15-16]。由圖7E可知，補骨脂素在內(nèi)蒙古自治區(qū)及黑龍江省所產(chǎn)關(guān)防風中含量顯著高于安徽省、河北省、山西省產(chǎn)地，可作為標志物。而花椒毒素含量則低于以上3個地區(qū)，可能與環(huán)境導致其次生代謝途徑差異密切相關(guān)，雖然含量顯著降低，仍可清晰區(qū)分關(guān)防風，也可作為質(zhì)量差異標志物。由圖7F可知，通過對道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)的紫花前胡苷元含量對比發(fā)現(xiàn)差異無明顯規(guī)律性，不能作為質(zhì)量差異標志物。

4 討論

本研究廣泛收集了來自26個產(chǎn)地的共計78批防風樣本，代表性較強。不同產(chǎn)地防風中5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷、3’-O-乙酰亥茅酚、3’-O-當歸乙酰亥茅酚、紫花前胡苷元含量差異較大，而Ledeouriellol、亥茅酚、補骨脂素、花椒毒素也可以在一定程度上表征關(guān)防風與其他產(chǎn)地防風的差異，可以作為質(zhì)量差異標志物來鑒定關(guān)防風，未來需獲得更多的道地產(chǎn)區(qū)及非道地產(chǎn)區(qū)防風樣本，更大范圍驗證初步確定的質(zhì)量差異標志物的適用性。此外，由于對照品和檢測技術(shù)的限制，課題組后續(xù)僅對補骨脂素、花椒毒素含量限度進行了初步研究，未來仍需對其他質(zhì)量差異標志物進行分離、鑒定及含量測定，更加全面地評價防風道地藥材的質(zhì)量。

中藥道地品質(zhì)差異的化學實質(zhì)即是指藥用植（動）物代謝產(chǎn)物的差異，然而藥材次生代謝途徑是一個十分復雜的網(wǎng)絡，在缺乏對其代謝途徑整體研究的背景下，筆者認為可通過大樣本代謝譜測定與分析，確定一些質(zhì)量差異標志物的固定比例關(guān)系或比例范圍，能夠更好地區(qū)分道地藥材與非道地藥材。進一步尋找生物合成途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，揭示基因表達量與藥效成分含量之間的相關(guān)性，從而確定關(guān)鍵質(zhì)量差異標志物，為關(guān)防風的道地性成因研究、質(zhì)量評價標準的建立以及改良防風品種品質(zhì)提供了科學依據(jù)。