張玉婷，侯秀娟，劉小平，朱躍蘭

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科，北京 100078）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見的慢性、全身性自身免疫性疾病，以對稱性、多關(guān)節(jié)炎為主要特點(diǎn)。RA病程長且常常反復(fù)發(fā)作，具有發(fā)病率高和致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害患者的身心健康，影響患者的生活質(zhì)量。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因尚未完全闡明，多種促炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-17、IL-6、IL-1、IL-21及 IL-22等在RA的發(fā)病過程中起重要作用[1]。輔助性T細(xì)胞17（Th17）以及IL-17在RA發(fā)病中的重要作用越來越受重視[2-4]。其中，IL-17A通過相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可從多個方面加重RA關(guān)節(jié)處炎癥程度和關(guān)節(jié)損害[5]。此外，臨床上針對TNF-α、IL-1及IL-6的靶向藥物應(yīng)用較廣泛，此類生物制劑具有起效快、抑制骨破壞明顯等特點(diǎn)。本病屬于中醫(yī)“痹證”范疇，中醫(yī)藥干預(yù)RA具有不良反應(yīng)小、依從性好等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，探討芍甘附子湯加味對CIA大鼠模型關(guān)節(jié)病理改變及血清炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-17A及TNF-α的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雌性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

牛Ⅱ型膠原（CⅡ，批號：20022）購自美國Chondrex公司；不完全弗氏佐劑（IFA，批號：7002）購自美國Sigma公司；IL-2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、IL-17A ELISA檢測試劑盒及TNF-α ELISA檢測試劑盒均購自北京歐北生物科技有限公司；切片機(jī)（德國 Leica）；攤片機(jī)（德國 Leica）；包埋機(jī)（德國Leica）；自動脫水機(jī)（德國Leica）；倒置顯微鏡（Olymp）。

芍甘附子湯加味，方藥組成：制附子15 g，白芍15 g，甘草 10 g，雞血藤 15 g，青風(fēng)藤 15 g（以上藥物由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購，實(shí)驗(yàn)過程中保證所用藥品為同一批次，并由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定質(zhì)量控制），用前全部藥材經(jīng)煎煮（制附子先煎30 min）并過濾，水浴蒸發(fā)至其治療劑量每1 mL藥液含生藥材1.42 g。雷公藤多苷片：10 mg×100片/盒，購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：Z43020138，用前蒸餾水配制為1 mg/mL。

1.2 造模及分組 將24只大鼠隨機(jī)分出6只作為正常組，其余18只均建立CIA模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、雷公藤組、芍甘附子湯組，每組6只大鼠。造模方法：CⅡ溶于乙酸，與等體積IFA溶液混合，制備CⅡ終濃度2 mg/mL混合液，于大鼠左足底皮下按0.1 mL/足注射，尾根部多點(diǎn)注射0.1 mL/只，防止局部壞死。初次免疫后第8天尾根部注射抗原（0.1 mL/只）加強(qiáng)免疫1次。正常組大鼠左足皮下注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.3 干預(yù)方法 正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，不做任何處理；模型組：蒸餾水2 mL（/kg·d）灌胃；雷公藤組：雷公藤多苷片6.25 mg（/kg·d）灌胃；芍甘附子湯組：芍甘附子湯加味12.5 g（/kg·d）灌胃（依據(jù)人與動物體表面積換算的等效劑量）。各給藥組均在造模成功后開始灌胃給藥。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 灌胃結(jié)束后處死大鼠，取后右足踝關(guān)節(jié)去除皮膚和肌肉，10%中性甲醛溶液固定24 h，12.5%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）室溫中脫鈣，2 d換1次脫鈣液，30 d關(guān)節(jié)基本軟化后切片，HE染色，干燥并封片，顯微鏡下觀察脫鈣后關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 灌胃結(jié)束后，大鼠麻醉并腹主動脈取血，先以普通采血管取2 mL，室溫靜置1 h后，以3 000 r/min離心15 min，離心半徑為60 mm，分離血清，分裝于1.5 mL離心管中。ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 HE染色 正常組踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，未見滑膜組織增生及炎性細(xì)胞浸潤。模型組關(guān)節(jié)腔明顯狹窄，滑膜組織重度增生，局部壞死脫落，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯。雷公藤組關(guān)節(jié)腔局部略狹窄，關(guān)節(jié)面大部分光滑，局部軟骨脫落，滑膜組織輕微增生。芍甘附子湯組關(guān)節(jié)腔未見明顯狹窄，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，局部滑膜組織輕微增生。見圖1。

圖1 踝關(guān)節(jié)整體觀（×100）

正常組滑膜細(xì)胞1～2層，未見滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤。模型組滑膜組織明顯增厚，局部壞死脫落，大量滑膜細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤。雷公藤組可見局部滑膜組織膠原纖維增生，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)面局部血管翳侵入。芍甘附子湯組可見局部滑膜組織增生，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

2.2 血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平 與正常組比較，模型組IL-2水平增高（P＜0.01），與模型組比較，雷公藤組及芍甘附子湯組IL-2水平下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組IL-17A水平較正常組增加（P＜0.01），與模型組比較，雷公藤組及芍甘附子湯組IL-17A水平下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組TNF-α水平增高（P＜0.05），與模型組比較，雷公藤組TNF-α水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），芍甘附子湯組含量下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

表1 各組大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與雷公藤組比較，△P＜0.01。

組別 動物數(shù) IL-2 IL-17A TNF-α正常組 6 6.922±1.744 0.068±0.002 0.989±0.007模型組 6 9.478±2.195**0.081±0.010**1.054±0.044*雷公藤組 6 4.144±0.772# 0.063±0.008# 1.012±0.046芍甘附子湯組 6 4.867±0.869# 0.058±0.008# 0.917±0.014#△

3 討論

RA屬于自身免疫性疾病，其病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并出現(xiàn)關(guān)節(jié)的軟骨和骨破壞，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。RA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，實(shí)驗(yàn)動物模型仍是RA疾病研究的重要載體[6]。CIA模型在臨床癥狀、病理學(xué)改變、免疫反應(yīng)等方面都與人類RA特征高度相似，故CIA模型仍是目前公認(rèn)的最佳RA動物模型[7]，被廣泛用于研究疾病發(fā)病機(jī)制和驗(yàn)證治療靶點(diǎn)[8]。

多種細(xì)胞因子均與RA發(fā)病密切相關(guān)[9]，其中，TNF-α在活動性RA中參與多種致病機(jī)制，導(dǎo)致滑膜組織的炎癥增生、骨和軟骨的破壞、自身免疫反應(yīng)和RA并發(fā)癥等病理生理過程[10]。Hassan等[11]研究發(fā)現(xiàn)RA患者的滑液中存在高濃度的TNF-α，且與骨侵蝕有關(guān)。IL-17A是IL-17家族重要成員之一，近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)它在RA的發(fā)病與進(jìn)展中發(fā)揮作用[12-13]。IL-2由輔助性T細(xì)胞1（Th1）分泌，是激活T細(xì)胞、維持T細(xì)胞分化和增殖的重要細(xì)胞因子，可加重炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清IL-2水平明顯高于對照組，且血清IL-2水平與血漿紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平及28處關(guān)節(jié)疾病活動度（DAS28）評分呈正相關(guān)，與RA疾病活動度密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中TNF-α水平升高明顯且HE染色中關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯，血管翳形成，進(jìn)一步證實(shí)了TNF-α參與RA滑膜炎癥形成及對關(guān)節(jié)軟骨侵蝕的過程，而芍甘附子湯組中TNF-α水平顯著下降，且與雷公藤組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），HE染色結(jié)果可見雷公藤組關(guān)節(jié)腔局部略狹窄，局部關(guān)節(jié)軟骨脫落，而芍甘附子湯組關(guān)節(jié)腔未見明顯狹窄，關(guān)節(jié)軟骨表面平滑，未見關(guān)節(jié)軟骨脫落。由此可見，芍甘附子湯加味在降低TNF-α水平和抑制關(guān)節(jié)軟骨破壞方面優(yōu)于雷公藤組。在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中T淋巴細(xì)胞起著關(guān)鍵的作用。CD4+/CD8+比值的變化是RA發(fā)病及免疫損傷的核心環(huán)節(jié)，模型組IL-2、IL-17A水平與正常組相比均明顯升高（P＜0.01），與RA的活動呈正相關(guān)，提示炎性因子表達(dá)升高導(dǎo)致T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+之間相互抑制的平衡被打破，致使大鼠的細(xì)胞免疫功能降低，關(guān)節(jié)滑膜中淋巴細(xì)胞浸潤而發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，芍甘附子湯組可降低IL-2、IL-17A及TNF-α水平，提示芍甘附子湯加味可有效改善關(guān)節(jié)及滑膜炎癥，并對抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞有一定的作用。

芍甘附子湯加味是在張仲景《傷寒論》芍甘附子湯的基礎(chǔ)上加入雞血藤、青風(fēng)藤，常常用于痹證的治療。本課題組前期臨床研究結(jié)果顯示，芍甘附子湯加味可改善RA患者關(guān)節(jié)腫痛、晨僵等癥狀，與西藥聯(lián)用，可降低血沉水平?，F(xiàn)代藥理學(xué)亦證實(shí)，本方中單個藥物具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥及抑制滑膜細(xì)胞增殖等作用[15-16]。方中附子辛、熱，歸心、腎、脾經(jīng)，可補(bǔ)火助陽，通脈散寒止痛；白芍酸苦微寒，歸肝、脾經(jīng)，擅養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛，為治療四肢拘攣?zhàn)魍吹某Ｓ盟幹?；甘草，《注解傷寒論》認(rèn)為其“益虛補(bǔ)血?dú)舛鴱?fù)脈”，味甘性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，可補(bǔ)中堅(jiān)筋骨，緩急止痛；附子、甘草相配辛甘化陽，白芍、甘草相伍酸甘化陰，在此基礎(chǔ)上加用雞血藤、青風(fēng)藤以行血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)濕，與附子配伍以達(dá)溫陽通絡(luò)之效。5藥相合，邪正兼顧，標(biāo)本同治，共奏扶助正氣、調(diào)和陰陽、除濕散寒、化瘀通絡(luò)之功。雷公藤多苷片為治療RA的二線常用藥物之一，其治療RA療效顯著。研究表明，雷公藤多苷片治療RA發(fā)揮抗炎作用與降低血中前列腺素E2（PGE2）、TNF-α和IL-2等因子的產(chǎn)生和釋放有關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)所使用的中藥方劑為復(fù)方，各藥物之間通過君臣佐使配伍發(fā)揮協(xié)同作用，可作用于多個靶點(diǎn)發(fā)揮抑制滑膜炎癥和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。本研究選擇雷公藤多苷片作為陽性對照藥，初步探究其與本方藥在治療RA效果的差異，芍甘附子湯組中TNF-α水平顯著下降，且與雷公藤組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示芍甘附子湯加味在降低TNF-α水平方面優(yōu)于雷公藤組。

綜上所述，芍甘附子湯加味可改善CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，降低血清IL-2、IL-17A及TNF-α表達(dá)水平，本研究結(jié)果為芍甘附子湯加味干預(yù)RA提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時，本研究亦存在一定不足，如芍甘附子湯組和雷公藤組相比，IL-2和IL-17A水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將增加芍甘附子湯高、中、低劑量組，進(jìn)一步分析兩組之間的差異及降低炎性細(xì)胞水平與劑量依賴的相關(guān)性，并開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步豐富本方藥治療RA的生物學(xué)依據(jù)。