朱莉，姜遠(yuǎn)安，肖冠華，何志毅，李君軍

病毒性腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的一種疾病，伴有腦實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng)，病因復(fù)雜多樣，主要是腦實(shí)質(zhì)或腦膜被各種病毒入侵后所引起的一種感染性疾病，通常與機(jī)體的免疫功能低下有關(guān)[1-3]。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，兒童病毒性腦炎的發(fā)病率從3.5/10萬(wàn)～7.4/10萬(wàn)上升到了16/10萬(wàn)[4]。不同病情的病毒性腦炎患兒預(yù)后也不同，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)不同程度的發(fā)育遲緩、肢體癱瘓甚至死亡[5]。因此，早期識(shí)別不良預(yù)后的患兒，可以幫助醫(yī)生采取更有效的治療措施來(lái)改善患兒預(yù)后情況，但現(xiàn)在臨床上仍然缺乏預(yù)測(cè)不良預(yù)后的敏感生物學(xué)指標(biāo)。近年研究顯示，微小RNA(microRNA，miR)在調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用，多種miR可用作疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物[6-7]。據(jù)報(bào)道，miR-125b與炎性疾病的發(fā)展及T細(xì)胞分化有關(guān)，與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中有一定的診斷價(jià)值[8]。miR-125b是否通過(guò)T細(xì)胞分化影響病毒性腦炎的病理過(guò)程尚不清楚，與病毒性腦炎患兒預(yù)后的關(guān)系也未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究通過(guò)測(cè)定病毒性腦炎兒童血漿miR-125b水平，分析miR-125b與機(jī)體輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)平衡的關(guān)系，并探討影響病毒性腦炎患兒不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年11月湖南省郴州市第一人民醫(yī)院兒童危重癥科收治病毒性腦炎患兒110例為腦炎組，其中男72例，女38例，年齡1～12 (4.25±2.74)歲；住院時(shí)間7～38(23.42±13.83)d；臨床癥狀：發(fā)熱92例，頭痛46例，有意識(shí)改變56例，存在驚厥持續(xù)狀態(tài)34例，伴有應(yīng)激性高血糖35例；致病病毒：腸道病毒78例，巨細(xì)胞病毒16例，EB病毒11例，單純皰疹病毒1型3例，單純皰疹病毒2型2例。選取同期體檢健康兒童100例為健康對(duì)照組，男68例，女32例，年齡1～12(4.84±2.82)歲。2組對(duì)象的性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者家屬或其監(jiān)護(hù)人知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①病毒性腦炎患兒診斷符合國(guó)際腦炎聯(lián)合會(huì)兒童病毒性腦炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查資料完整；③年齡<14歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他細(xì)菌感染；②合并免疫系統(tǒng)疾病；③存在肝腎功能異常；④近期使用過(guò)糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血漿標(biāo)本采集：患兒于確診次日清晨/健康兒童于體檢當(dāng)日空腹采集肘靜脈血6 ml， 并儲(chǔ)存在含有肝素鈉的抗凝劑管中， 2 ml用于流式細(xì)胞術(shù)，4 ml于4℃離心，將血漿移至新EP管中，在-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存用于檢測(cè)血漿miR-125b水平和炎性因子水平。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血漿miR-125b水平：使用血漿RNA提取試劑盒(哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司)提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州易錦生物技術(shù)有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。miR-125b正向引物序列：5'-GATCTGCAGCTCTCCCAGGGGCTGGCTTCAG-3'，反向引物序列：5'-GATCATATGGAGGCAGAAAGGATGGAGAAGT-3'；U6作為內(nèi)參，其正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，反應(yīng)體系包括：SYBR Green染料、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、ddH2O；反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，連續(xù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，miR-125b的表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

1.3.3 Th17和Treg細(xì)胞檢測(cè)：上述血液2 ml使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞，使用PBS緩沖液將血細(xì)胞稀釋至8 ml，加入到人淋巴細(xì)胞分離液的界面上， 于4℃時(shí)離心獲得血清，使用PBS緩沖液洗滌2次，使用流式細(xì)胞儀(艾森生物NovoCyte)檢測(cè)Th17和Treg，計(jì)算Th17/Treg比值。

1.3.4 血漿炎性因子檢測(cè)：使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)白介素17(IL-17)、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平，試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 預(yù)后判斷： 隨訪6個(gè)月，收集相關(guān)信息，使用兒童格拉斯哥預(yù)后量表(GOS)[10]評(píng)估病毒性腦炎患兒預(yù)后。GOS 1級(jí)：死亡；GOS 2級(jí)：植物狀態(tài)；GOS 3級(jí)：日常生活學(xué)習(xí)無(wú)法自理，需要照料，嚴(yán)重殘疾；GOS 4級(jí)：日常生活學(xué)習(xí)可獨(dú)立，輕度殘疾；GOS 5級(jí)：恢復(fù)良好，日常生活學(xué)習(xí)可自理，正?；顒?dòng)。將GOS評(píng)級(jí)1～3級(jí)劃分為預(yù)后差亞組， 4～5級(jí)為預(yù)后良好亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血漿miR-125b、Th17、Treg和Th17/Treg比值比較 腦炎組患兒血漿miR-125b、Th17水平和Th17/Treg比值顯著高于健康對(duì)照組，Treg水平顯著低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 2組受試者血漿miR-125b、Th17、

2.2 2組炎性細(xì)胞因子比較 腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平均高于健康對(duì)照組，IL-10和TGF-β水平均低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組受試者血漿IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較

2.3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 110例病毒性腦炎患兒中，預(yù)后良好72例(65.45%)，預(yù)后不良38例(34.55%)。 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組患兒的意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、是否有應(yīng)激性高血糖、腦CT異常、腦MR異常、血漿miR-125b、Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同預(yù)后患兒的性別、年齡、發(fā)熱和頭痛比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 [例

2.4 miR-125b、Th17/Treg、炎性因子與預(yù)后的相關(guān)性 腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.810/0.000、0.689/0.004、0.778/0.000、0.793/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.797/0.000、-0.748/0.000)；腦炎組患兒血漿Th17/Treg與IL-17、IL-6及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.873/0.000、0.701/0.004、0.878/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.644/0.018、-0.796/0.000)。

2.5 病毒性腦炎預(yù)后多因素Logistic回歸分析 將上述結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸分析，其中因變量為病毒性腦炎患兒預(yù)后(1=不良，0=良好)，自變量為意識(shí)改變(1=有，0=無(wú))，驚厥持續(xù)狀態(tài)(1=有，0=無(wú))，腦CT異常(1=有，0=無(wú))，腦MR異常(1=有，0=無(wú))，應(yīng)激性高血糖(1=有，0=無(wú))，血漿miR-125b(實(shí)際值)，Th17/Treg比值(實(shí)際值)、IL-17(實(shí)際值)、IL-6(實(shí)際值)、IL-10(實(shí)際值)和TGF-β(實(shí)際值)。結(jié)果顯示，有意識(shí)改變、有驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、有應(yīng)激性高血糖、血漿miR-125b水平升高是病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 病毒性腦炎患兒預(yù)后多因素分析

3 討 論

兒童病毒性腦炎是兒科的常見(jiàn)病，會(huì)引起腦組織水腫、壞死、腦功能損害等病理改變，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、頭痛、意識(shí)改變、抽搐、癲癇發(fā)作和局灶性神經(jīng)功能缺失等癥狀，嚴(yán)重影響兒童的生活質(zhì)量和生命健康。當(dāng)兒童抵抗力降低時(shí)，病毒可以侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng)[11]。T細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，主要分為T(mén)reg、Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞[12]。Th17是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，與Treg在功能上相互抑制，二者在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，Th17/Treg失衡可導(dǎo)致感染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生[13-14]。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒性腦炎患兒血漿Th17水平和Th17/Treg比值高于健康對(duì)照組，Treg水平低于健康對(duì)照組，說(shuō)明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)Th17細(xì)胞活化，Treg細(xì)胞抑制，從而出現(xiàn)Th17/Treg失衡，這一現(xiàn)象與既往研究中細(xì)胞感染病毒后，可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞活化，抑制Treg細(xì)胞活化的結(jié)論相吻合[15]。本結(jié)果顯示，腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平顯著高于健康對(duì)照組，IL-10和TGF-β水平顯著低于健康對(duì)照組，說(shuō)明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的炎性反應(yīng)，這是因?yàn)門(mén)h17可以產(chǎn)生IL-17和IL-6等細(xì)胞因子，參與中性粒細(xì)胞的增殖、趨化和激活，導(dǎo)致細(xì)胞組織炎性損傷[16]。Treg主要分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用，TGF-β通過(guò)反饋調(diào)節(jié)維持Treg數(shù)量和功能，同時(shí)還可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和分化[16]。病毒性腦炎患兒體內(nèi)Th17/Treg失衡，進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子(IL-17和IL-6)分泌增加，抗炎性細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)分泌減少，導(dǎo)致腦組織炎性損傷加重，這些機(jī)制可能參與了兒童病毒性腦炎的病理過(guò)程。

miR是一種非編碼單鏈RNA，可以與mRNA結(jié)合抑制mRNA的翻譯過(guò)程，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)[6-7]，既往研究顯示，miR-125b與炎性疾病的發(fā)展和機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)[8]，本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦炎組患兒血漿miR-125b水平顯著高于健康對(duì)照組，說(shuō)明miR-125b可能參與了病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg、預(yù)后均呈正相關(guān)，與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)，表明miR-125b可能是通過(guò)影響Th17/Treg的平衡狀態(tài)，進(jìn)而引起炎性因子釋放紊亂，介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生來(lái)參與病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程和預(yù)后。miR-125b引起Th17/Treg失衡的機(jī)制可能與視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3有關(guān)，目前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以影響視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，而視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt在Th17分泌IL-17過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能[17]，因此miR-125b可能通過(guò)上述途徑影響病毒性腦炎患兒機(jī)體內(nèi)Th17/Treg的平衡，從而影響患兒的預(yù)后。

此外，本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素主要有意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高。印澄瑩等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，意識(shí)改變的患者內(nèi)側(cè)前額葉、腦干和胼胝體的損傷較其他部位明顯增高，腦MR也顯示意識(shí)障礙患者的執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)和默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)的功能連接強(qiáng)度降低，與預(yù)后GCS評(píng)分有關(guān)。腦CT異常和腦MR異常直接或間接說(shuō)明腦實(shí)質(zhì)受損，病毒性腦炎MR表現(xiàn)為病灶廣泛，可累及各個(gè)部位，出現(xiàn)彌漫性腦組織腫脹甚至病灶出血，累及范圍越大，預(yù)后越差[19]。驚厥持續(xù)狀態(tài)可以導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元死亡，從而引起腦損傷，驚厥持續(xù)時(shí)間和次數(shù)都影響患兒的預(yù)后[20]。應(yīng)激性高血糖通常伴有低鈉血癥和低鈣血癥，加速機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致疾病惡化，此外高血糖可以引發(fā)高滲血癥，易引起意識(shí)障礙和抽搐[21]，從而影響患兒的預(yù)后。本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，血漿miR-125b水平升高也影響患兒的預(yù)后，這可能與miR-125b可引起視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Th17/Treg失衡和炎性反應(yīng)加重有關(guān)。

綜上所述，miR-125b與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，促進(jìn)Th17/Treg失衡，參與病毒性腦炎的發(fā)病過(guò)程，此外，意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高是影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素。但miR-125b如何通過(guò)機(jī)體的免疫反應(yīng)介導(dǎo)病毒性腦炎的病理過(guò)程，還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

朱莉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě);姜遠(yuǎn)安、肖冠華：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改;何志毅：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李君軍：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核