朱莉,姜遠(yuǎn)安,肖冠華,何志毅,李君軍
病毒性腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的一種疾病,伴有腦實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng),病因復(fù)雜多樣,主要是腦實(shí)質(zhì)或腦膜被各種病毒入侵后所引起的一種感染性疾病,通常與機(jī)體的免疫功能低下有關(guān)[1-3]。 據(jù)統(tǒng)計(jì),兒童病毒性腦炎的發(fā)病率從3.5/10萬(wàn)~7.4/10萬(wàn)上升到了16/10萬(wàn)[4]。不同病情的病毒性腦炎患兒預(yù)后也不同,嚴(yán)重者可能出現(xiàn)不同程度的發(fā)育遲緩、肢體癱瘓甚至死亡[5]。因此,早期識(shí)別不良預(yù)后的患兒,可以幫助醫(yī)生采取更有效的治療措施來(lái)改善患兒預(yù)后情況,但現(xiàn)在臨床上仍然缺乏預(yù)測(cè)不良預(yù)后的敏感生物學(xué)指標(biāo)。近年研究顯示,微小RNA(microRNA,miR)在調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用,多種miR可用作疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物[6-7]。據(jù)報(bào)道,miR-125b與炎性疾病的發(fā)展及T細(xì)胞分化有關(guān),與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān),在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中有一定的診斷價(jià)值[8]。miR-125b是否通過(guò)T細(xì)胞分化影響病毒性腦炎的病理過(guò)程尚不清楚,與病毒性腦炎患兒預(yù)后的關(guān)系也未見(jiàn)報(bào)道,因此本研究通過(guò)測(cè)定病毒性腦炎兒童血漿miR-125b水平,分析miR-125b與機(jī)體輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)平衡的關(guān)系,并探討影響病毒性腦炎患兒不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,報(bào)道如下。
1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年11月湖南省郴州市第一人民醫(yī)院兒童危重癥科收治病毒性腦炎患兒110例為腦炎組,其中男72例,女38例,年齡1~12 (4.25±2.74)歲;住院時(shí)間7~38(23.42±13.83)d;臨床癥狀:發(fā)熱92例,頭痛46例,有意識(shí)改變56例,存在驚厥持續(xù)狀態(tài)34例,伴有應(yīng)激性高血糖35例;致病病毒:腸道病毒78例,巨細(xì)胞病毒16例,EB病毒11例,單純皰疹病毒1型3例,單純皰疹病毒2型2例。選取同期體檢健康兒童100例為健康對(duì)照組,男68例,女32例,年齡1~12(4.84±2.82)歲。2組對(duì)象的性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),受試者家屬或其監(jiān)護(hù)人知情同意,并簽署知情同意書(shū)。
1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①病毒性腦炎患兒診斷符合國(guó)際腦炎聯(lián)合會(huì)兒童病毒性腦炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查資料完整;③年齡<14歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他細(xì)菌感染;②合并免疫系統(tǒng)疾病;③存在肝腎功能異常;④近期使用過(guò)糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物。
1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法
1.3.1 血漿標(biāo)本采集:患兒于確診次日清晨/健康兒童于體檢當(dāng)日空腹采集肘靜脈血6 ml, 并儲(chǔ)存在含有肝素鈉的抗凝劑管中, 2 ml用于流式細(xì)胞術(shù),4 ml于4℃離心,將血漿移至新EP管中,在-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存用于檢測(cè)血漿miR-125b水平和炎性因子水平。
1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血漿miR-125b水平:使用血漿RNA提取試劑盒(哈爾濱新?;驒z測(cè)有限公司)提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州易錦生物技術(shù)有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。miR-125b正向引物序列:5'-GATCTGCAGCTCTCCCAGGGGCTGGCTTCAG-3',反向引物序列:5'-GATCATATGGAGGCAGAAAGGATGGAGAAGT-3';U6作為內(nèi)參,其正向引物序列:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向引物序列:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl,反應(yīng)體系包括:SYBR Green染料、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、ddH2O;反應(yīng)條件:94 ℃ 1 min預(yù)變性,95 ℃ 15 s變性,60 ℃ 20 s退火,72 ℃ 20 s延伸,連續(xù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,miR-125b的表達(dá)水平用2-△△Ct表示。
1.3.3 Th17和Treg細(xì)胞檢測(cè):上述血液2 ml使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞,使用PBS緩沖液將血細(xì)胞稀釋至8 ml,加入到人淋巴細(xì)胞分離液的界面上, 于4℃時(shí)離心獲得血清,使用PBS緩沖液洗滌2次,使用流式細(xì)胞儀(艾森生物NovoCyte)檢測(cè)Th17和Treg,計(jì)算Th17/Treg比值。
1.3.4 血漿炎性因子檢測(cè):使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)白介素17(IL-17)、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平,試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.3.5 預(yù)后判斷: 隨訪6個(gè)月,收集相關(guān)信息,使用兒童格拉斯哥預(yù)后量表(GOS)[10]評(píng)估病毒性腦炎患兒預(yù)后。GOS 1級(jí):死亡;GOS 2級(jí):植物狀態(tài);GOS 3級(jí):日常生活學(xué)習(xí)無(wú)法自理,需要照料,嚴(yán)重殘疾;GOS 4級(jí):日常生活學(xué)習(xí)可獨(dú)立,輕度殘疾;GOS 5級(jí):恢復(fù)良好,日常生活學(xué)習(xí)可自理,正?;顒?dòng)。將GOS評(píng)級(jí)1~3級(jí)劃分為預(yù)后差亞組, 4~5級(jí)為預(yù)后良好亞組。
2.1 2組血漿miR-125b、Th17、Treg和Th17/Treg比值比較 腦炎組患兒血漿miR-125b、Th17水平和Th17/Treg比值顯著高于健康對(duì)照組,Treg水平顯著低于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表1。
表1 2組受試者血漿miR-125b、Th17、
2.2 2組炎性細(xì)胞因子比較 腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平均高于健康對(duì)照組,IL-10和TGF-β水平均低于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表2。
表2 2組受試者血漿IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較
2.3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 110例病毒性腦炎患兒中,預(yù)后良好72例(65.45%),預(yù)后不良38例(34.55%)。 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組患兒的意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、是否有應(yīng)激性高血糖、腦CT異常、腦MR異常、血漿miR-125b、Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同預(yù)后患兒的性別、年齡、發(fā)熱和頭痛比例比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。
表3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 [例
2.4 miR-125b、Th17/Treg、炎性因子與預(yù)后的相關(guān)性 腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.810/0.000、0.689/0.004、0.778/0.000、0.793/0.000),與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.797/0.000、-0.748/0.000);腦炎組患兒血漿Th17/Treg與IL-17、IL-6及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.873/0.000、0.701/0.004、0.878/0.000),與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.644/0.018、-0.796/0.000)。
2.5 病毒性腦炎預(yù)后多因素Logistic回歸分析 將上述結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸分析,其中因變量為病毒性腦炎患兒預(yù)后(1=不良,0=良好),自變量為意識(shí)改變(1=有,0=無(wú)),驚厥持續(xù)狀態(tài)(1=有,0=無(wú)),腦CT異常(1=有,0=無(wú)),腦MR異常(1=有,0=無(wú)),應(yīng)激性高血糖(1=有,0=無(wú)),血漿miR-125b(實(shí)際值),Th17/Treg比值(實(shí)際值)、IL-17(實(shí)際值)、IL-6(實(shí)際值)、IL-10(實(shí)際值)和TGF-β(實(shí)際值)。結(jié)果顯示,有意識(shí)改變、有驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、有應(yīng)激性高血糖、血漿miR-125b水平升高是病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。
表4 病毒性腦炎患兒預(yù)后多因素分析
兒童病毒性腦炎是兒科的常見(jiàn)病,會(huì)引起腦組織水腫、壞死、腦功能損害等病理改變,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、頭痛、意識(shí)改變、抽搐、癲癇發(fā)作和局灶性神經(jīng)功能缺失等癥狀,嚴(yán)重影響兒童的生活質(zhì)量和生命健康。當(dāng)兒童抵抗力降低時(shí),病毒可以侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起腦實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng)[11]。T細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞,主要分為T(mén)reg、Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞[12]。Th17是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群,與Treg在功能上相互抑制,二者在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,Th17/Treg失衡可導(dǎo)致感染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生[13-14]。
本結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒性腦炎患兒血漿Th17水平和Th17/Treg比值高于健康對(duì)照組,Treg水平低于健康對(duì)照組,說(shuō)明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)Th17細(xì)胞活化,Treg細(xì)胞抑制,從而出現(xiàn)Th17/Treg失衡,這一現(xiàn)象與既往研究中細(xì)胞感染病毒后,可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞活化,抑制Treg細(xì)胞活化的結(jié)論相吻合[15]。本結(jié)果顯示,腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平顯著高于健康對(duì)照組,IL-10和TGF-β水平顯著低于健康對(duì)照組,說(shuō)明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的炎性反應(yīng),這是因?yàn)門(mén)h17可以產(chǎn)生IL-17和IL-6等細(xì)胞因子,參與中性粒細(xì)胞的增殖、趨化和激活,導(dǎo)致細(xì)胞組織炎性損傷[16]。Treg主要分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用,TGF-β通過(guò)反饋調(diào)節(jié)維持Treg數(shù)量和功能,同時(shí)還可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和分化[16]。病毒性腦炎患兒體內(nèi)Th17/Treg失衡,進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子(IL-17和IL-6)分泌增加,抗炎性細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)分泌減少,導(dǎo)致腦組織炎性損傷加重,這些機(jī)制可能參與了兒童病毒性腦炎的病理過(guò)程。
miR是一種非編碼單鏈RNA,可以與mRNA結(jié)合抑制mRNA的翻譯過(guò)程,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)[6-7],既往研究顯示,miR-125b與炎性疾病的發(fā)展和機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)[8],本結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦炎組患兒血漿miR-125b水平顯著高于健康對(duì)照組,說(shuō)明miR-125b可能參與了病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg、預(yù)后均呈正相關(guān),與IL-10和TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān),表明miR-125b可能是通過(guò)影響Th17/Treg的平衡狀態(tài),進(jìn)而引起炎性因子釋放紊亂,介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生來(lái)參與病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程和預(yù)后。miR-125b引起Th17/Treg失衡的機(jī)制可能與視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3有關(guān),目前有研究發(fā)現(xiàn),miR-125b可以影響視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá),而視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt在Th17分泌IL-17過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用,轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)蛋白,調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能[17],因此miR-125b可能通過(guò)上述途徑影響病毒性腦炎患兒機(jī)體內(nèi)Th17/Treg的平衡,從而影響患兒的預(yù)后。
此外,本結(jié)果還發(fā)現(xiàn),影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素主要有意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高。印澄瑩等[18]的研究發(fā)現(xiàn),意識(shí)改變的患者內(nèi)側(cè)前額葉、腦干和胼胝體的損傷較其他部位明顯增高,腦MR也顯示意識(shí)障礙患者的執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)和默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)的功能連接強(qiáng)度降低,與預(yù)后GCS評(píng)分有關(guān)。腦CT異常和腦MR異常直接或間接說(shuō)明腦實(shí)質(zhì)受損,病毒性腦炎MR表現(xiàn)為病灶廣泛,可累及各個(gè)部位,出現(xiàn)彌漫性腦組織腫脹甚至病灶出血,累及范圍越大,預(yù)后越差[19]。驚厥持續(xù)狀態(tài)可以導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元死亡,從而引起腦損傷,驚厥持續(xù)時(shí)間和次數(shù)都影響患兒的預(yù)后[20]。應(yīng)激性高血糖通常伴有低鈉血癥和低鈣血癥,加速機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào),導(dǎo)致疾病惡化,此外高血糖可以引發(fā)高滲血癥,易引起意識(shí)障礙和抽搐[21],從而影響患兒的預(yù)后。本結(jié)果還發(fā)現(xiàn),血漿miR-125b水平升高也影響患兒的預(yù)后,這可能與miR-125b可引起視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致Th17/Treg失衡和炎性反應(yīng)加重有關(guān)。
綜上所述,miR-125b與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān),促進(jìn)Th17/Treg失衡,參與病毒性腦炎的發(fā)病過(guò)程,此外,意識(shí)改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高是影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素。但miR-125b如何通過(guò)機(jī)體的免疫反應(yīng)介導(dǎo)病毒性腦炎的病理過(guò)程,還需要進(jìn)一步研究。
利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突
作者貢獻(xiàn)聲明
朱莉:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);姜遠(yuǎn)安、肖冠華:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;何志毅:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;李君軍:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核