尹夢婕 劉國平 李怡慧 姜波 白霜 李凌緒

摘要：為了確定菵（Beckmanniasyzigachne）乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）Trp-1999-Leu突變對種子萌發(fā)的影響，采用衍生酶切擴增序列多態(tài)性法（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）從JS-26種群中分離出基因背景一致的1999位突變純合子（1999Trp/Trp，RR）和野生型（1999Leu/Leu，SS），并在室內(nèi)測定其種子萌發(fā)的動態(tài)差異，及在pH、水分、鹽等脅迫下的萌發(fā)差異。結(jié)果表明，Trp-1999-Leu突變能夠提高菵種子的萌發(fā)率，使菵種子在偏酸性或偏堿性條件下的萌發(fā)率降低;但能顯著提高菵種子萌發(fā)對水分和鹽脅迫的耐受力，水勢為-0.4MPa時，RR萌發(fā)率比SS高23個百分點，NaCl濃度為80mmol/L時，RR的萌發(fā)率為SS的4.4倍。

關(guān)鍵詞：菵;乙酰輔酶A羧化酶;Trp-1999-Leu突變;種子萌發(fā)

中圖分類號：S451 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0044-06

菵（Beckmanniasyzigachne）為禾本科菵屬一年生或越年生雜草，喜濕，是我國稻茬麥田主要雜草之一[1]。精唑禾草靈是乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）抑制劑類除草劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于芳氧苯氧丙酸酯類（Aryloxyphenoxypropionates，APP），通過抑制禾本科雜草脂肪酸合成起到除草作用，是我國小麥田苗后選擇性防治菵的主要藥劑之一[2]。目前我國稻茬麥田菵已對精唑禾草靈產(chǎn)生了明顯抗性，靶標(biāo)酶ACCase特定氨基酸的突變是其重要的抗性機理之一，其中Trp-1999-Leu是菵中最新發(fā)現(xiàn)的抗性突變[3-5]。在除草劑存在的情況下，抗性基因可為雜草帶來收益，但在沒有除草劑存在時，可能帶來適合度代價[6]。萌發(fā)是雜草重要的生理過程，對植物生長發(fā)育有重要影響。本試驗以基因背景一致的ACCasee1999位突變純合體菵（RR）和1999位野生型菵（SS）為材料，研究Trp-1999-Leu突變對菵種子萌發(fā)的影響，以期為菵抗性進化、抗性菵治理等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菵（JS-26）種子于2012年6月采集于江蘇省丹陽市，在田間隨機采集50株以上菵種子，置紙袋內(nèi)，室內(nèi)晾干，于4℃保存。敏感種群（SD-12）2013年6月采自山東省泰安市，采集、保存等方法同上。

1.2 種子萌發(fā)與幼苗培養(yǎng)

取成熟飽滿、大小一致的菵種子置于鋪有濾紙的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入5mL清水，潤濕種子，于光照培養(yǎng)箱中催芽，L∶D=12h∶12h，光照12000Lux，白晝20℃、夜晚10℃，每日換水。胚芽生長至1cm左右時移栽于裝有疏松壤土的花盆中（直徑15cm，高9cm），壤土采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，未施用過除草劑。菵置于15～28℃溫室內(nèi)，自然光照，每兩日澆水一次。用于抗性水平測定的菵每盆移入7株，生長至三葉期間苗，每盆保留5株長勢一致的幼苗;用于衍生酶切擴增序列多態(tài)性（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）分析的菵每盆移入一株。

1.3 JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平

采用整株法測定JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平，以SD-12種群為對照。將精唑禾草靈（69g/L水乳劑，拜耳）配制成如表1所示的系列濃度，使用移動噴霧塔（3WP-2000，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所）以Teejet-9503EVS型扇形噴嘴在0.28MPa下噴霧處理，噴液量450L/hm2。每盆作為一個處理，每處理重復(fù)3次，以噴施清水為對照。處理21d后，剪取地上部植株稱量鮮重，使用SigmaPlot12.5（Systat）的雙邏輯非線性回歸模型（公式1）計算鮮重抑制中濃度（GR50）。

式中，Y為該除草劑用量下雜草地上部鮮重抑制率;C為劑量反應(yīng)下限;D為劑量反應(yīng)上限;X為除草劑用量;GR50為鮮重抑制中濃度;b為斜率。

根據(jù)公式2計算抗性水平（RI）。

1.4 ACCase基因克隆與測序

在菵3～4葉期采集葉片約50mg，采用CTAB法提取總DNA[7]。根據(jù)Li等[8]的方法擴增菵質(zhì)體ACCase基因CT區(qū)域序列，引物為FP：5′TTTCCCAGCGGCAGACAGAT3′，RP：5′TCCCTGGAGTCTTGCTTTCA3′。PCR 反應(yīng)體系（25μL）：FP（20μmol/L）1μL、RP（20μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反應(yīng)緩沖液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.2μL、DNA1μL、雙蒸水17.25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸100s，共35個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5μL，在1%瓊脂糖凝膠上140V電泳30min，溴化乙錠（EB）染色后，檢測目的條帶。隨后將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序，測序結(jié)果用DNAMAN9.0（LynnonLLC，SanRamon，CA）進行序列比對分析。JS-26種群共采集25株進行測序比對，取樣后的植株噴施精唑禾草靈觀察表型，劑量為62.1ga.i./hm2。

1.5 dCAPS分析試驗

參考Xu等[9]的方法進行，通過錯配引物引入HindⅢ的酶切位點（A^AGCTT），分析JS-26菵質(zhì)體ACCase第5996位的SNP（G/T）。使用引物為W1999LF：5′TGATTCCCACGAGCGGTCTGTTCCTCGTGCTGGGCAAAGCT3′（下劃線為錯配的堿基），W1999LR：5′TTGAGTTCCTCTGACCTGA3′。PCR反應(yīng)體系（25μL）：DNA1μL、W1999LF（10μmol/L）1μL、W1999LR（10μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反應(yīng)緩沖液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.25μL、雙蒸水17.25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，共34個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保溫。經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色確認目的條帶后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL經(jīng)HindⅢ37℃酶切2h，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后進行分析。經(jīng)內(nèi)切酶消化后，野生型（SS）應(yīng)該有一條390bp的條帶，純合突變型（RR）應(yīng)該有一條可見的349bp條帶和一條不可見的41bp條帶，雜合突變型（RS）應(yīng)該同時存在349bp和390bp兩種帶型。根據(jù)dCAPS分析結(jié)果，將SS和RR分別置于不同溫室培養(yǎng)，收取種子，室內(nèi)晾干，置4℃待用。

1.6 最適條件下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

分別在種子采集當(dāng)天與室溫儲存4個月后進行試驗，萌發(fā)條件同1.2。每皿放入25粒種子，重復(fù)4次。胚根或胚芽長度超過種子一半時視為萌發(fā)，每天記錄萌發(fā)種子數(shù)量，并將其移出皿外，連續(xù)觀察20d。

1.7 不同pH值環(huán)境下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

分別配制pH為4、6、8、10的緩沖液[10，11]，按1.2的方法使菵種子在不同pH值緩沖液中萌發(fā)，以去離子水（pH=6.5）為對照，每處理重復(fù)4次，20d后記錄種子萌發(fā)數(shù)。

1.8 水分脅迫下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

配制不同濃度聚乙二醇-6000（PEG-6000）溶液，使水勢分別為0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6MPa[12]，按1.2的方法萌發(fā)種子，每處理重復(fù)4次，20d后記錄種子萌發(fā)數(shù)。

1.9 鹽脅迫下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

配制濃度分別為0、10、20、40、80、160、320mmol/L的NaCl溶液，以蒸餾水作對照，萌發(fā)條件同1.2，每處理重復(fù)4次，20d后記錄種子萌發(fā)數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

試驗整體重復(fù)3次，使用SPSS20.0（IBM）對3次試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若3組數(shù)據(jù)無顯著性差異（P>0.05），將數(shù)據(jù)合并。使用Sigmaplot軟件（Systat）對種子萌發(fā)過程進行非線性擬合。鹽脅迫、水分脅迫和不同pH值條件下萌發(fā)率的差異顯著性利用獨立樣本t檢驗（α=0.05）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平

整株法測定結(jié)果表明（圖1），JS-26種群對精唑禾草靈的GR50值為（3554.08±110.22）ga.i./hm2;SD-12種群對精唑禾草靈的GR50值為（6.29±0.13）ga.i./hm2?？梢奐S-26種群已對精唑禾草靈產(chǎn)生高水平抗性（RI=565）。

2.2 ACCase基因克隆與測序

擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，發(fā)現(xiàn)在約1437bp處獲得目的條帶（圖2）。測序比對后發(fā)現(xiàn)，在25株供試植株中，3株ACCase1999位氨基酸密碼子為TTG，編碼色氨酸（Trp），對精唑禾草靈敏感;16株1999位密碼子為TGG，編碼亮氨酸（Leu），6株1999位密碼子為TTG/TGG，編碼色氨酸/亮氨酸（Trp/Leu），均對精唑禾草靈表現(xiàn)出耐受性。Trp-1999-Leu突變已在日本看麥娘等雜草中得到鑒定，可使ACCase對精唑禾草靈等藥劑的敏感性降低，是導(dǎo)致禾本科雜草對芳氧苯氧丙酸酯類除草劑產(chǎn)生抗性的突變位點之一[9]。

2.3 dCAPS分析

反應(yīng)完成后對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，可見在390bp處有明顯且唯一的條帶，與預(yù)期目標(biāo)符合，可用于后續(xù)試驗。擴增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ酶切后電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。泳道3在349bp處有單一條帶，為突變純合子（RR）;2、4、5、6在390bp處有單一條帶，為野生型（SS）;1在349bp和390bp處均有條帶，為突變型雜合子（RS）。應(yīng)用此方法對JS-26種群96株菵進行檢測，得到RR型（1999Leu/Leu）79株，RS型（1999Leu/Trp）1株，SS型（1999Trp/Trp）16株。

2.4 最適條件下RR、SS型菵種子萌發(fā)動態(tài)差異

由圖4可知，在種子采集當(dāng)天進行試驗，RR型菵種子的tG50（萌發(fā)率達到50%所用時間）為14.7～16.8d，SS型菵種子的tG50為14.8～15.6d，二者無顯著差異;RR型菵種子最終萌發(fā)率（73%）略高于SS型（65%），但差異不顯著。室溫儲存明顯縮短了菵種子萌發(fā)所需時間，RR型和SS型菵種子的tG50分別縮短至7.5～8.4d和7.6～9.7d，且無顯著差異;儲存后RR型菵種子萌發(fā)率（99%）顯著高于SS型？ 草種子（87%）?？梢娛覝貎Υ?個月可顯著縮短菵種子萌發(fā)時間，且Trp-1999-Leu突變顯著提高了菵種子萌發(fā)率。

2.5 不同pH值下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

如表2所示，菵種子的萌發(fā)對pH值變化不敏感，在pH為4～10范圍內(nèi)，兩基因型菵種子萌發(fā)率均在70%以上。對比兩基因型菵種子萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)，除pH=6.0時，RR型的萌發(fā)率均顯著低于SS型。

2.6 水分脅迫下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

菵種子萌發(fā)對滲透壓比較敏感，當(dāng)滲透壓為-0.1MPa時萌發(fā)率開始大幅降低，滲透壓低于-0.4MPa時種子的萌發(fā)率低于50%，在-0.6MPa時萌發(fā)率低于10% （表3）。在滲透壓為-0.1、-0.2、-0.6MPa時，RR型菵種子萌發(fā)率與SS型無顯著差異;在滲透壓為-0.3、-0.4、-0.5MPa時，RR型菵種子的萌發(fā)率顯著高于SS型，分別高18、23、17個百分點。

2.7 鹽脅迫下RR、SS型菵種子萌發(fā)差異

菵種子萌發(fā)對NaCl敏感，當(dāng)NaCl濃度達到20mmol/L時萌發(fā)率明顯降低，濃度達到160mmol/L時SS型菵種子不能萌發(fā)。RR型菵種子萌發(fā)對NaCl的耐受性更強，在NaCl濃度為20、40、80mmol/L時萌發(fā)率均顯著高于SS型（表4）。

3 討論與結(jié)論

菵是長江中下游地區(qū)稻茬麥田的主要雜草之一，已對精唑禾草靈、炔草酯等ACCase抑制劑普遍產(chǎn)生了抗性[13]。質(zhì)體ACCase特定氨基酸的突變是菵對精唑禾草靈產(chǎn)生抗性的重要機理，已從菵中鑒定出了Ile-1781-Leu、Ile-1781-Val、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等抗性突變[3，4]。質(zhì)體ACCase1999位氨基酸Trp突變也可能導(dǎo)致對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性，Trp-1999-Cys是1999位最先發(fā)現(xiàn)的抗性突變形式，Liu[14]、Jang[15]等將該突變導(dǎo)入酵母，重組酵母對精唑禾草靈和精喹禾靈產(chǎn)生了抗性。Liu等[5]證實菵Trp-1999-Leu突變對精唑禾草靈、精喹禾靈、唑酰草胺等具有雙環(huán)芳香基的APP類品種具有中等至高水平的抗性，對炔草酯等僅具單環(huán)芳香基的APP類品種無抗性。

為了應(yīng)對不同生境的選擇壓力，雜草在不同空間中經(jīng)常發(fā)生生態(tài)型分化，使不同地理種群在許多與適合度代價相關(guān)的位點上表現(xiàn)出遺傳變異[16，17]。因此，控制遺傳背景是適合度代價研究的重要前提。從單個群體中鑒定、分離抗性和敏感個體是常用的控制遺傳背景的方法之一[18，19]。本研究采用dCAPS法從JS-26種群鑒定分離出1999位抗性純合子（1999Leu/Leu，RR）和敏感野生型（1999Trp/Trp，SS），獲得了遺傳背景一致的材料，消除了其他位點的干擾。

抗性雜草種子的萌發(fā)動態(tài)會影響其在田間的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在最適條件下，儲存可使菵種子萌發(fā)時間縮短，且RR型萌發(fā)率顯著高于SS型。Du等[21]研究了不同突變對菵種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)Ile-1781-Leu、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等突變對儲存后菵種子萌發(fā)的tG50沒有顯著影響。Vila-Aiub等[22]發(fā)現(xiàn)ACCaseIle-1781-Leu突變使大穗看麥娘（Alopecurusmyosuroides）種子萌發(fā)的tG50升高，Ile-2041-Asn突變則對種子萌發(fā)沒有影響。可見同一突變形式對種子萌發(fā)的影響在種間呈現(xiàn)一定程度差異。

菵種子萌發(fā)對酸堿度不敏感，pH值4～10范圍內(nèi)均適宜其萌發(fā)，在偏酸性（pH=4）或偏堿性（pH為8～10）條件下，RR種子萌發(fā)率顯著低于SS。干旱脅迫和鹽脅迫對菵種子萌發(fā)影響顯著。滲透壓達到-0.1MPa時菵種子萌發(fā)率迅速下降，與Du等[21]的結(jié)果一致。在本研究中，ACCaseTrp-1999-Leu突變增強了菵種子對干旱脅迫的耐受力，在滲透壓為-0.3、-0.4、-0.5MPa時，RR型萌發(fā)率顯著高于SS型。NaCl濃度對菵種子萌發(fā)也有一定影響，濃度達到20mmol/L時，菵種子萌發(fā)率出現(xiàn)明顯下降。與SS型相比，RR型對鹽脅迫的耐受性更高，說明ACCaseTrp-1999-Leu突變提高了菵種子萌發(fā)對鹽的耐受力。Du等[21]研究了ACCase不同突變在干旱脅迫和鹽脅迫下對菵種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)Ile-1781-Leu突變可提高干旱脅迫下菵種子的萌發(fā)率，在野燕麥（Avenaludoviciana）上的研究則表明Asn-2041-Ile突變不會影響種子萌發(fā)對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[23]。

本試驗表明菵ACCaseTrp-1999-Leu突變降低了菵種子對酸堿的耐受性，但增強了對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性，對抗性菵的分布可能會產(chǎn)生一定影響。