王艷旭 ，李世舉 ，鐘曉勇 ，梁 暉 ，劉建忠

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

腦梗死是導(dǎo)致全球人口死亡的三大疾病之一，具有高發(fā)病率、高病死率及高致殘率的特點(diǎn)，不僅嚴(yán)重危害人民的健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也給患者及其家庭和國(guó)家?guī)沓林氐尼t(yī)療、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前治療腦梗死最有效的方法是血管再通治療［1］，但血管再通后存在缺血再灌注損傷，該過程引發(fā)氧自由基損傷、鈣離子內(nèi)流等病理過程，往往會(huì)加重腦梗死并引發(fā)一系列腦梗死后遺癥，因此各類神經(jīng)保護(hù)制劑的研發(fā)及應(yīng)用一直是臨床研究的熱點(diǎn)［2-6］，而中醫(yī)藥因其多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢(shì)在治療缺血再灌注損傷方面發(fā)揮著重要作用，也受到越來越多關(guān)注［5］。本課題組前期研究表明，天麻鉤藤飲具有抗氧化作用，它不僅能升高谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT）水平，清除過多的氧自由基，還能降低丙二醛（MDA）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，減輕腦梗死后的氧化應(yīng)激反應(yīng)［7-8］，但其具體抗氧化分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）／血紅素加氧酶1（HO-1）信號(hào)通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的重要途徑，Nrf2／HO-1信號(hào)通路的激活可以減輕腦缺血再灌注損傷，有利于腦缺血神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)［4，9］。 因此本研究擬從 Nrf2 ／HO-1 信號(hào)通路探討天麻鉤藤飲治療急性腦梗死的分子機(jī)制，以期為該方劑在臨床推廣應(yīng)用奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（300±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，恒溫恒濕，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 天麻鉤藤飲組方：天麻9 g，鉤藤（后下）12 g，石決明（先煎）20 g，山梔子 9 g，黃芩 9 g，川牛膝 15 g，杜仲 15 g，益母草 15 g，桑寄生 15 g，夜交藤15 g，茯神12 g，炙甘草3 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房制備，最終藥物濃度為3 g／mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 全反式維甲酸（美國(guó)Sigma公司）；AB204-N 電子天平（梅特勒公司）；HO-1、Nrf2兔抗人多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；β-actin（美國(guó)CST公司）；BH-2系統(tǒng)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；PCR儀、Gel DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)、APC 300電泳儀、水平電泳槽（美國(guó)BioRad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、天麻鉤藤飲組、阻斷劑組，每組10只。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型。具體方法如下：應(yīng)用10%水合氯醛按0.35 g／kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定于定位儀上，切開右側(cè)頸部皮膚，分離并在根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈，從右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉下方約3～4 mm處剪一“V”型小口，將3 cm尼龍線插入，當(dāng)有阻力時(shí)停止插入，此時(shí)尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約為18 mm，待缺血90 min后撥出線栓再灌注，固定尼龍線并縫合皮膚。大鼠造模蘇醒后出現(xiàn)以下現(xiàn)象說明模型制備成功：缺血對(duì)側(cè)前爪不能伸直，出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒。假手術(shù)組將正常SD大鼠麻醉后固定于定位儀上，切開右側(cè)頸部皮膚，只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸外動(dòng)脈，不插入尼龍線，縫合皮膚。

2.2 干預(yù) 天麻鉤藤飲組自造模成功后3 h內(nèi)開始灌服天麻鉤藤飲混懸液15 g／（kg·d），每日2次。阻斷劑組在天麻鉤藤飲灌胃的基礎(chǔ)上（方式同天麻鉤藤飲組），腹腔注射全反式維甲酸［30 mg／（kg·d），溶于二甲基亞砜中］，每日2次。假手術(shù)組和模型組于同一時(shí)間點(diǎn)開始灌服生理鹽水，每次1 mL，每日2次。4組均連續(xù)灌服3 d。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 造模后及術(shù)后每天均采用盲法記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Zea Longa的五級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn)［10］，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自行行走或昏迷。動(dòng)物蘇醒后評(píng)分在1～4分者為有效模型，評(píng)分＜1者或在取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)有血塊和Willis環(huán)有血栓者予以剔除。

2.4 HE染色 將大鼠腦組織用多聚甲醛灌注后固定48 h，常規(guī)石蠟包埋后切片，依次脫蠟、脫水、蘇木素及伊紅染色，脫水后透明中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 RT-PCR檢測(cè)腦梗死側(cè)皮層組織Nrf2、HO-1mRNA水平 大鼠麻醉后斷頭處死，在冰盤上快速取出腦組織，按TRIZOL試劑盒說明的步驟提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，電泳查看RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。Nrf2 上游引物：5’-AACGCTACGACGTGGAGACAG A-3’，下游引物：5’-GTCATGCATTCCACACTGTCC AGA-3’；HO-1 上游引物：5’-AGGTGCACATCCGT GCAGAG-3’，下游引物：5’-CTTCCAGGGCCGTATA GATATGGTA-3’。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用熒光定量PCR儀采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行PCR定量分析。

2.6 Western blot檢測(cè)腦梗死側(cè)皮層組織 Nrf2、HO-1蛋白表達(dá) 超聲破碎含腦組織的lysis緩沖液，離心取上清液，進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。取50 ug蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜，5%無脂牛奶封閉，以及一抗、二抗的孵育，顯影。掃描。Image J圖像分析軟件行圖像分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 4組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 模型組神經(jīng)功能評(píng)分較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）。天麻鉤藤飲組治療可以降低神經(jīng)功能評(píng)分（P＜0.05），而阻斷劑組可以逆轉(zhuǎn)天麻鉤藤降低神經(jīng)功能評(píng)分的作用（P＜0.05），見圖 1。

圖1 4組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

3.2 大鼠皮質(zhì)病理形態(tài)觀察 假手術(shù)組可見神經(jīng)元胞體較大，多角形（多個(gè)突起），核著色淺，胞質(zhì)可見特征性結(jié)構(gòu)尼氏體。而模型組神經(jīng)元皺縮，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，胞漿嗜依紅染色增強(qiáng)，尼氏體邊聚或消失，核固縮，有的胞體變形縮小，呈三角形，細(xì)胞周圍間隙增寬。天麻鉤藤飲可以在一定程度上減輕缺血再灌注所致的病理損傷，而阻斷劑組則會(huì)阻斷天麻鉤藤飲的治療作用，見圖2。

圖2 4組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)HE染色圖（×20）

3.3 4組皮層組織中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 天麻鉤藤飲能夠上調(diào)大腦皮層組織中Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），而應(yīng)用Nrf2／HO-1通路阻斷劑（全反式維甲酸）則會(huì)阻斷天麻鉤藤飲的上調(diào)作用（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖 3 4組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)比較

圖 4 4組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較

4 討論

腦梗死發(fā)生時(shí)，梗死區(qū)域腦組織自由基和其他有害化學(xué)基團(tuán)迅速增多，導(dǎo)致線粒體功能障礙，加重興奮毒性，促進(jìn)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA過氧化損傷和炎癥反應(yīng)等［11］。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是腦損傷的基本機(jī)制。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化應(yīng)答的核心途徑之一，能夠顯著誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答。Nrf2信號(hào)通路的缺失或激活障礙，會(huì)加重氧化應(yīng)激狀態(tài)、破壞細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡，甚至死亡。研究表明，缺血腦組織Nrf2表達(dá)顯著上調(diào)，多種Nrf2誘導(dǎo)劑在腦缺血后均具有神經(jīng)保護(hù)作用［4］。在大鼠局灶性腦缺血模型研究中發(fā)現(xiàn)，Nrf2表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)出現(xiàn)腦梗死體積縮小、腦水腫減輕和神經(jīng)功能改善，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Nrf2，誘導(dǎo)其下游抗氧化酶和解毒酶的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化作用［9］。HO-1亦稱熱休克蛋白、是一種拮抗氧化應(yīng)激的抗氧化酶，是Nrf2調(diào)控的下游目的基因，近年來，HO-1的神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用越來越受到重視，因?yàn)樗芡ㄟ^產(chǎn)生CO和膽紅素發(fā)揮腦損傷的抗氧化保護(hù)作用。HO-1／膽紅素／CO共同組成了機(jī)體不可缺少的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，廣泛參與抗炎與多種急慢性氧化應(yīng)激損傷，在防止高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘等多種疾病中起重要作用［12］。綜上，Nrf2／HO-1信號(hào)通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的重要途徑，調(diào)控Nrf2／HO-1信號(hào)通路的表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)作用。

天麻鉤藤飲源自《雜病證治新義》，方中天麻、鉤藤為君藥，平肝熄風(fēng)；石決明為臣藥，與君藥合用，加強(qiáng)平肝熄風(fēng)之力；杜仲、桑寄生以補(bǔ)益肝腎，以固其本；黃芩、梔子清熱瀉火，瀉肝經(jīng)之熱；夜交藤、茯神以寧心安神；川牛膝引血下行，益母草活血利水，體現(xiàn)“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”之理。諸藥配伍，共奏平肝熄風(fēng)、清熱活血、補(bǔ)益肝腎之功效。

本研究結(jié)果顯示，天麻鉤藤飲可以降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分（P＜0.05），提示天麻鉤藤飲可以改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。同時(shí)天麻鉤藤飲可以減輕缺血再灌注損傷所致的病理改變，其具體分子作用機(jī)制可能與激活了Nrf2／HO-1信號(hào)通路有關(guān)。此外，鞏敏杰等［13］研究表明，Nrf2表達(dá)在腦梗死后呈一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，梗死后1～2 d腦組織Nrf2表達(dá)升高，在第3天左右下降。該結(jié)論和本研究結(jié)果一致，模型組第3天Nrf2的表達(dá)水平與假手術(shù)組無差異，而HO-1的高表達(dá)持續(xù)至第3天；但和模型組比較，在第3天天麻鉤藤飲可以進(jìn)一步上調(diào)Nrf2及HO-1的表達(dá)，提示在腦梗死急性期天麻鉤藤飲可能通過持續(xù)激活Nrf2／HO-1信號(hào)通路而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的康復(fù)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。